Quantifier la taille du foie chez le poisson zèbre larvaire à l'aide de la microscopie Brightfield
Summary
Ici nous démontrons une méthode pour quantifier la taille du foie dans le poisson zèbre larvaire, fournissant un moyen d’évaluer les effets des manipulations génétiques et pharmacologiques sur la croissance et le développement de foie.
Abstract
Dans plusieurs modèles transgéniques de poisson zèbre du carcinome hépatocellulaire (HCC), l’hépatomegaly peut être observé pendant les étapes larvaires tôt. La quantification de la taille du foie larvaire dans les modèles HCC du poisson zèbre fournit un moyen d’évaluer rapidement les effets des médicaments et d’autres manipulations sur un phénotype lié à l’oncogène. Ici, nous montrons comment fixer les larves de poissons zèbres, disséquer les tissus entourant le foie, photographier les foies à l’aide de microscopie de champ lumineux, mesurer la région du foie, et analyser les résultats. Ce protocole permet une quantification rapide et précise de la taille du foie. Comme cette méthode consiste à mesurer la région du foie, elle peut sous-estimer les différences dans le volume du foie, et des méthodologies complémentaires sont nécessaires pour différencier entre les changements dans la taille des cellules et les changements dans le nombre de cellules. La technique de dissection décrite ci-dessus est un excellent outil pour visualiser le foie, l’intestin, et le pancréas dans leurs positions naturelles pour une myriade d’applications en aval, y compris la coloration d’immunofluorescence et l’hybridation in situ. La stratégie décrite pour quantifier la taille du foie larvaire s’applique à de nombreux aspects du développement et de la régénération du foie.
Introduction
Le carcinome hépatocellulaire (HCC) est la malignité primaire la plus commune du foie1 et la troisième cause principale de mortalité cancer-connexe2. Pour mieux comprendre les mécanismes de l’hépatocarcinogenèse et identifier les thérapeutiques HCC potentielles, nous et d’autres avons développé le poisson zèbre transgénique dans lequel l’expression hépatocyte-spécifique des oncogènes tels que la caténine3,4, Kras(V12)5,6, Myc7, ou Yap18 conduit à HCC chez les animaux adultes. Chez ces poissons zèbres, l’élargissement du foie est noté dès 6 jours après la fécondation (dpf), fournissant une plate-forme facile pour tester les effets des médicaments et des altérations génétiques sur la surcroissance du foie induite par les oncogènes. La mesure précise et précise de la taille du foie larvaire est essentielle pour déterminer les effets de ces manipulations.
La taille et la forme du foie peuvent être évaluées de façon semi-quantitative chez les larves fixes de poissons zèbres par CY3-SA étiquetant9 ou chez les larves vivantes de poissons zèbres à l’aide de reporters fluorescents spécifiques à l’hépatocyte et de la microscopie disséquer la fluorescence5,6. Cette dernière méthode est relativement rapide, et son manque de précision peut être abordé en photographiant et en mesurant la zone de chaque foie à l’aide d’un logiciel de traitement d’image7,10. Cependant, il peut être techniquement difficile de positionner uniformément toutes les larves vivantes dans une expérience telle que la région bidimensionnelle du foie est une représentation précise de la taille du foie. Une technique similaire pour quantifier la taille du foie consiste à utiliser la microscopie de fluorescence des feuilles légères pour quantifier le volume du foie larvaire8, qui peut être plus précis pour détecter les différences de taille lorsque le foie est élargi de façon non uniforme dans différentes dimensions. Le tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS) peut être utilisé pour compter le nombre d’hépatocytes étiquetés fluorescents et d’autres types de cellules hépatiques dans les foies larvaires8,11. Dans cette méthode, les foies larvaires sont mis en commun et dissociés, de sorte que l’information sur la taille et la forme du foie individuel est perdue. En combinaison avec une autre méthode de détermination de la taille du foie, FACS permet la différenciation entre l’augmentation du nombre de cellules (hyperplasie) et l’augmentation de la taille des cellules (hypertrophie). Toutes ces méthodes utilisent une technologie de fluorescence coûteuse (microscope ou trieur de cellules) et, à l’exception de l’étiquetage CY3-SA, nécessitent l’étiquetage des hépatocytes avec un journaliste fluorescent.
Ici, nous décrivons en détail une méthode pour quantifier la zone du foie larvaire de poisson zèbre à l’aide de microscopie de champ lumineux et de logiciel de traitement d’image3,12,13,14. Ce protocole permet une quantification précise de la zone des foies individuels in situ sans l’utilisation de la microscopie de fluorescence. Tout en analysant la taille du foie, nous aveuglons l’identité de l’image pour réduire les biais des chercheurs et améliorer la rigueur scientifique15.
Protocol
Representative Results
Discussion
La quantification de la taille du foie est cruciale dans les études visant à comprendre le développement du foie, la régénération et l’oncogénèse. Le protocole décrit ici est une technique relativement rapide, facile et bon marché pour la quantification de la taille du foie chez le poisson zèbre larvaire. Faire preuve de prudence tout en exécutant certains aspects du protocole peut aider à une plus grande exactitude des résultats et à une diminution de la frustration.
Une bonne …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Maurine Hobbs et la Ressource animale centralisée du poisson zèbre (CZAR) de l’Université de l’Utah pour avoir fourni de l’élevage de poissons zèbres, de l’espace de laboratoire et de l’équipement pour effectuer des parties de cette recherche. L’expansion de la CZAR est soutenue en partie par la subvention des NIH no 1G20OD018369-01. Nous tenons également à remercier Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum et le Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility pour les soins du poisson zèbre. Nous tenons à remercier Kenneth Kompass pour son aide dans le programme R. Ces travaux ont été financés en partie par des subventions de la Huntsman Cancer Foundation (en conjonction avec la subvention P30 CA042014 accordée au Huntsman Cancer Institute) (KJE) et nih/NCI R01CA222570 (KJE).
Materials
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -. C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. 암 연구학. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. 암 연구학. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
