ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करलारल जेब्राफिश में जिगर का आकार मात्रा
Summary
यहां हम लार्वा जेब्राफिश में जिगर के आकार की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करते हैं, जो यकृत के विकास और विकास पर आनुवंशिक और फार्माकोलॉजिक जोड़तोड़ के प्रभावों का आकलन करने का एक तरीका प्रदान करते हैं।
Abstract
हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) के कई ट्रांसजेनिक जेब्राफिश मॉडल में, हेपेटोमेगाली प्रारंभिक लार्वा चरणों के दौरान मनाया जा सकता है। जेब्राफिश एचसीसी मॉडल में लार्वा जिगर के आकार का मात्रा निर्धारित करने से ऑन्कोजीन से संबंधित फेनोटाइप पर दवाओं और अन्य जोड़तोड़ के प्रभावों का तेजी से आकलन करने का साधन प्रदान करता है। यहां हम ज़ेब्राफिश लार्वा को ठीक करने, यकृत के आसपास के ऊतकों को विच्छेदन करने, उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके फोटोग्राफ यकृत, यकृत क्षेत्र को मापने और परिणामों का विश्लेषण करने का तरीका दिखाते हैं। यह प्रोटोकॉल जिगर के आकार के तेजी से, सटीक मात्रा करण को सक्षम बनाता है। चूंकि इस विधि में यकृत क्षेत्र को मापना शामिल है, यह यकृत की मात्रा में अंतर को कम कर सकता है, और कोशिका के आकार में परिवर्तन और सेल संख्या में परिवर्तन के बीच अंतर करने के लिए पूरक पद्धतियों की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित विच्छेदन तकनीक प्रतिरक्षण और सीटू संकरण सहित असंख्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अपने प्राकृतिक पदों में जिगर, आंत और अग्न्याशय की कल्पना करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है। लार्वा जिगर के आकार की मात्रा निर्धारित करने के लिए वर्णित रणनीति जिगर के विकास और उत्थान के कई पहलुओं पर लागू होती है।
Introduction
हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) जिगर1 का सबसे आम प्राथमिक द्रोह और कैंसर से संबंधित मृत्यु दर2का तीसरा प्रमुख कारण है । हेपेटोकार्सिनोजेनेसिस के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने और संभावित एचसीसी चिकित्सा की पहचान करने के लिए, हमने और अन्य ने ट्रांसजेनिक जेब्राफिश विकसित की है जिसमें हेपेटोसाइट-विशिष्ट अभिव्यक्ति ऑन्कोजीन जैसे कि ओकोजीन3, 4,क्रास (V12)5,6,Myc7,या Yap18 वयस्क जानवरों में एचसीसी की ओर जाता है। इन जेब्राफिश में, लिवर इज़ाफ़ा को निषेचन (डीपीएफ) के बाद 6 दिनों के रूप में जल्दी नोट किया जाता है, जो ऑन्कोजीन-चालित लिवर ओवरग्रोथ पर दवाओं और आनुवंशिक परिवर्तनों के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए एक फेसियल प्लेटफॉर्म प्रदान करता है। इन जोड़तोड़ के प्रभावों का निर्धारण करने के लिए लार्वा यकृत आकार का सटीक और सटीक माप आवश्यक है।
जिगर के आकार और आकार का मूल्यांकन CY3-SA लेबलिंग9 द्वारा या लाइव जेब्राफिश लार्वा में हेपेटोसाइट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और फ्लोरेसेंस विच्छेदन माइक्रोस्कोपी5,6द्वारा फिक्स्ड जेब्राफिश लार्वा में अर्ध-मात्रात्मक रूप से किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध विधि अपेक्षाकृत त्वरित है, और छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर7,10का उपयोग करके प्रत्येक यकृत के क्षेत्र को फोटोग्राफ और मापने के द्वारा सटीक की कमी को संबोधित किया जा सकता है। हालांकि, एक प्रयोग में सभी जीवित लार्वा को समान रूप से स्थिति में रखना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है कि दो-आयामी यकृत क्षेत्र यकृत के आकार का सटीक प्रतिनिधित्व है। जिगर के आकार की मात्रा के लिए एक समान तकनीक में लार्वा यकृत की मात्रा8को निर्धारित करने के लिए प्रकाश शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना शामिल है, जो आकार के अंतर का पता लगाने के लिए अधिक सटीक हो सकता है जब जिगर को विभिन्न आयामों में गैर-समान रूप से विस्तारित किया जाता है। फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (FACS) का उपयोग लार्वा यकृत8,11में फ्लोरोसेंटलेबल लेबल हेपेटोसाइट्स और अन्य यकृत कोशिका प्रकारों की संख्या को गिनने के लिए किया जा सकता है। इस विधि में, लार्वा यकृत को पूल किया जाता है और अलग किया जाता है, इसलिए व्यक्तिगत यकृत आकार और आकार के बारे में जानकारी खो जाती है। एक और जिगर के आकार निर्धारण विधि के साथ संयोजन में, FACS वृद्धि हुई सेल संख्या (हाइपरप्लासिया) और बढ़ी हुई सेल आकार (हाइपरट्रॉफी) के बीच भेदभाव को सक्षम बनाता है। इन तरीकों के सभी महंगी फ्लोरेसेंस प्रौद्योगिकी (माइक्रोस्कोप या सेल सॉर्टर) को रोजगार और, CY3-एसए लेबलिंग के अलावा, एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ हेपेटोसाइट्स की लेबलिंग की आवश्यकता है ।
यहां हम ब्राइट-फील्ड माइक्रोस्कोपीऔर इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर3,12,13,14का उपयोग करके जेब्राफिश लार्वा लिवर क्षेत्र की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विधि का विस्तार से वर्णन करते हैं । यह प्रोटोकॉल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के उपयोग के बिना सीटू में व्यक्तिगत यकृत के क्षेत्र की सटीक मात्रा को सक्षम बनाता है। जिगर के आकार का विश्लेषण करते समय, हम अन्वेषक पूर्वाग्रह को कम करने और वैज्ञानिक कठोरता15में सुधार करने के लिए छवि पहचान अंधा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
जिगर के विकास, उत्थान और ऑनकोजेनेसिस को समझने के उद्देश्य से अध्ययनों में यकृत के आकार का परिमाणीकरण महत्वपूर्ण है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल लार्वा जेब्राफिश में जिगर के आकार की मात्रा के लिए अपेक्षाकृ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस शोध के कुछ हिस्सों को पूरा करने के लिए जेब्राफिश पशुपालन, प्रयोगशाला अंतरिक्ष और उपकरण प्रदान करने के लिए यूटा विश्वविद्यालय में मूत्र हाब्स और केंद्रीकृत जेब्राफिश पशु संसाधन (CZAR) को स्वीकार करना चाहते हैं। जार का विस्तार एनआईएच ग्रांट # 1G20OD018369-01 द्वारा भाग में समर्थित है। हम रॉडने स्टीवर्ट, च्लोए लिम, लांस ग्राहम, कोड़ी जेम्स, गैरेट निकम और जेब्राफिश केयर के लिए व्याध कैंसर संस्थान (एचसीआई) जेब्राफिश सुविधा का भी शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । हम आर प्रोग्रामिंग के साथ मदद के लिए केनेथ Kompass शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को व्याध कैंसर फाउंडेशन से अनुदान द्वारा भाग में वित्त पोषित किया गया था (अनुदान P30 CA042014 के साथ संयोजन के रूप में व्याध कैंसर संस्थान) (KJE) और NIH/NCI R01CA222570 (KJE) को संमानित किया ।
Materials
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
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