يصف هذا التقرير فحص المنظفات المختلفة لإعداد GPCR البصرية، رودوبسين، ومجمعها مع مصغرة Go. يتم عرض الطرق الكيميائية الحيوية التي تميز نوعية المجمع في مراحل مختلفة أثناء التنقية. يمكن تعميم هذا البروتوكول على مجمعات بروتين غشاء أخرى لدراساتهم الهيكلية في المستقبل.
المفتاح لتحديد الهياكل البلورية للمجمعات البروتينية الغشائية هو جودة العينة قبل التبلور. على وجه الخصوص ، فإن اختيار المنظفات أمر بالغ الأهمية ، لأنه يؤثر على استقرار المجمع وتشتته. لقد حددنا مؤخرًا الهيكل البلوري لحالة نشطة من الرودوبسين البقري إلى جانب بروتين G المهندس ، mini-Go، بدقة 3.1 Å. هنا، نحن بالتفصيل إجراءات لتحسين إعداد rhodopsin-mini-G-O مجمع.o تم إعداد رودوبسين الحالة الداكنة في المنظفات الكلاسيكية والنيوبينتيل جليكول (NPG) ، تليها تشكيل معقد مع Mini-Go تحت التعرض للضوء. تم تقييم استقرار رودوبسين من خلال التحليل الطيفي المرئي للأشعة فوق البنفسجية (UV-VIS) ، والذي يراقب إعادة التشكيل إلى رودوبسين في ليغاند الحساسللضوء ، 9-cisal. تم استخدام الكروماتوغرافيا التلقائية للاستبعاد من الحجم (SEC) لتوصيف التشتت الأحادي للرودوبسين ومركب رودوبسين-مينيجي. SDS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) أكد تشكيل المجمع من خلال تحديد نسبة 1:1 الأضراس بين رودوبسين وميني جيس بعد تلطيخ الجل مع الأزرق كوماسي. بعد التحقق من صحة جميع هذه البيانات التحليلية ، تخلصنا من المنظفات غير المناسبة واستمرنا مع أفضل المنظفات المرشحة لإعداد وتبلور على نطاق واسع. نشأت مشكلة إضافية من عدم تجانس N-glycosylation. لوحظ أن رودوبسين المعبر عنه بشكل مغاير على SDS-PAGE يحتوي على مجموعتين مختلفتين من N-glycosylated ، والتي ربما كانت ستعوق تولد البلورات. لذلك ، تم اختبار إنزيمات deglycosylation المختلفة ، وأنتجت endoglycosidase F1 (EndoF1) رودوبسين مع نوع واحد من N-glycosylation. مع هذا الخط الاستراتيجي لتوصيف جودة البروتين ، تم تحسين إعدادمركب rhodopsin-mini-G لتقديم الهيكل البلوري. كان هذا فقط الهيكل البلوري الثالث لمركب إشارات البروتين GPCR-G. ويمكن أيضا أن يكون هذا النهج معممة للبروتينات الغشائية الأخرى ومجمعاتها لتسهيل إعداد العينة وتحديد الهيكل.
كان تحديد الهياكل البلورية للبروتينات الغشائية ومجمعاتها دائمًا تحديًا بسبب الصعوبات في الحصول على بلورات جيدة الانتشار. على النقيض من البروتينات القابلة للذوبان ، تتكون بروتينات الغشاء المتكاملة من نواة كارهة للماء تمتد عبر غشاء الخلية. لإزالة بروتينات الغشاء من غشاء الخلية إلى عازل مائي ، يجب استخدام المنظفات لتشكيل micelle المنظفات البروتينية ، وبالتالي استبدال الدهون حول جوهر الكاره للماء من بروتينات الغشاء. يعتمد استقرار ونشاط وسلامة بروتينات الغشاء بشكل مباشر على الخصائص الكيميائية والهيكلية للمنظفات1، كما تحدد خصائص المنظفات حجم الميكيل. قد المنظفات micelle كبيرة انسداد الأسطح المائية من بروتين غشاء صغير، وبالتالي منع تبلور بسبب عدم وجود اتصالات الكريستال عند استخدام طريقة نشر البخار. المنظفات الصغيرة micelle مفيد لعلم البلورات، ولكن المنظفات سلسلة قصيرة عادة ما تكون أقسى، وبالتالي تؤدي إلى زعزعة الاستقرار وتجميع البروتين الغشاء. لذلك ، قبل التبلور ، لا غنى عن إجراء فحص المنظفات الإضافي ، وعادة ما يستهدف المنظفات الأقصر التي لا تزال تحافظ على استقرار البروتين.
مستقبلات G المقترنة بالبروتين (GPCRs) هي بروتينات غشاء متكاملة تحتوي على سبعة من الهيليسات العابرة للأغشية. توجد GPCRs في ولايتين رئيسيتين ، إما حالة غير نشطة استقرت بواسطة ناهضات أو خصوم عكسية ، أو حالة نشطة مرتبطة بناهض واستقرت ببروتين G ، على الرغم من أنه من المرجح أن العديد من الدول الفرعية موجودة بين هذين النقيضين. وضع هيكل تحديد GPCRs في البداية على الدول غير النشطة ملزمة بناهضات عكسية وخصوم بسبب استقرارها أعلى من الدول النشطة2. عندما يتم تنشيط GPCRs على ربط ناهض، ومستقبلات ديناميكية للغاية، وأشكال مشقوق عابرة على الوجه السيتوبلازمي لمستقبلات لاقتران البروتين G. ويعتقد أن هذه الديناميكية هي السبب في أن GPCRs المنضمة إلى ناهض غالبا ما تكون أكثر اضطرابا من الدولة غير النشطة. لذلك ، يصبح من الضروري فحص المنظفات المناسبة للحالة التشكيلية للمستقبلات قيد الدراسة ، لأنه من المرجح أن تكون هناك حاجة إلى منظفات أكثر اعتدالًا لدراسة حالة نشطة مقارنة بحالة غير نشطة.
في هذا التقرير، ونحن نستخدم GPCR البصرية، الردوبسين البقري3،ومجمعها مع ميني Gس البروتين4،,5 لتجارب فحص المنظفات، تمثل الدولة غير النشطة والدولة النشطة، على التوالي. ركز فحص المنظفات على منظفات الألكيل الكلاسيكية والغلوكوسايد والمنظفات neopentyl glycol (NPG). في هذا السياق ، يتم بناء المنظفات الكلاسيكية من مجموعة رأس السكر وسلسلة ألكيل ، في حين أن المنظفات من نوع NPG تحتوي على منظفات كلاسيكية متطابقة تنصهر بواسطة كربون رباعي في الواجهة بين السكريات وسلاسل الألكيل6،7،8.
تم تصميم سير عمل تجريبي بدءًا من تنقية الرودوبسين في المنظفات المختلفة ، يليه تشكيل مركب رودوبسين – ميني جيوتنتهي بتوصيف المجمع باستخدام عدة طرق(الشكل 1). بالنسبة للحالة غير النشطة للرودوبسين ، تم رصد إعادة تشكيل ligand 9-cis الحساسة للضوء عن طريق التحليل الطيفي المرئي للأشعة فوق البنفسجية (UV-VIS). الطيف يكشف عن الحالة الفيزيائية الكيميائية للشبكية ويدل على بيئتها في جيب ربط الشبكية من رودوبسين. تم استخدام الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) لتقييم monodispersity من رودوبسين المنقى وكذلك تشكيلo rhodopsin-mini-G-o المركب. كما SEC يميز جزيئات البروتين حسب حجمها وشكلها، يمكن تحديد السكان البروتين المجمعة لأنها elute في حجم الفراغ. لتأكيد التكوين المعقد ، تم تقييم الكسور من SEC بواسطة الصوديوم dodecyl كبريتات البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) لتأكيد وجود كل من رودوبسين وميني جيس.
عامل آخر يحتاج إلى النظر هو التعديلات ما بعد الترجمة (PTM) على بروتينات الغشاء. PTM مثل N-glycosylation غالبا ما لوحظ على بروتينات غشاء eukaryotic المنتجة في الثدييات ونظم التعبير عن الخلايا الحشرية. تم تطوير سلالة محدودة N-glycosylation من الكلى الجنينية البشرية 293 (HEK293) الخلايا عن طريق حذف الجين ترميز N-acetylglucosamsaminyltransferase الأول (GnTI)، مما أدى إلى متجانسة N-glycosylation من قبل GlcNAc2مان5 في موقع الإجماع Asn-X-Ser/Thr. على الرغم من أنه يمكن منع N-glycosylation عن طريق تحور بقايا الأحماض الأمينية في موقع الإجماع، وهذا قد يغير أيضا وظيفة البروتين أو كفاءة للطي. في رودوبسين البقري، طفرة من بقايا N-غليكوزيل Asn15 يؤدي إلى طي غير صحيحة وانخفاض تنشيط البروتين G9،,10. وقد أعرب عن رودوبسين المستخدمة في هذا التقرير في HEK 293 GnTI نقص خط الخلية. ومع ذلك ، أظهرت SDS-PAGE وجود نوعين من رودوبسين. هذا التغايرية يمكن أن تمنع تكوين الكريستال، وبالتالي تم اختبار deglycosylation باستخدام الببتيد-N-glycosidase F (PNGase F) وendoglycosidase F1 (إندو F1). وقد تميز المنتج deglycosylated SDS-PAGE والطيف اللوني السائل (LC-MS) لتحديد مستوى الجليكوزيل وتجانسه.
يعتمد النجاح في تبلور البروتين بقوة على عينة البروتين ، وخاصة البروتينات الغشائية ومجمعاتها بسبب المضاعفات التي تسببها المنظفات. يوضح هذا التقرير فحص المنظفات وتقييم جودة العينة لمجمعات إشارات البروتين GPCR-mini-G. وقد استخدمت على نطاق واسع مجموعة متنوعة من الأساليب لدراسة الخاصية الكيميائية الحيوية للبروتينات غشاء، على سبيل المثال، وتحليل الحرارة باستخدام الأصباغ الفلورية16،17، والمواد الملزمة للكشف عن تشكيل معقدة عن طريق قياس التغيير في إشارة الفلور سمرة التربتوفان18 أو نقل الطاقة بالرنين مع أجهزة الاستشعار الحيوية19. ومع ذلك ، فإن البيئات الكيميائية المستخدمة في هذه الأساليب تختلف تمامًا عن تلك الخاصة بإعداد عينة التبلور ، إما أن البروتينات تكون عند تركيز أقل ألف مرة للقياس القائم على الفلورسينس ، أو البروتينات مضمنة في طبقات الدهون أو في حالة منظفات ثابتة واحدة. في هذا البروتوكول ، يتم توحيد الأساليب المستخدمة أيضًا في إعداد العينة على نطاق واسع قبل التبلور. لذلك ، يمكن نقل المعلمات المحسنة بسهولة لإعداد مقياس التبلور دون مزيد من الفحص والتحسين الرئيسي.
الهدف من هذا البروتوكول هو تحسين إعداد مجمع بروتين GPCR-mini-G مستقر ومتجانس لتبلور انتشار البخار وتحديد الهيكل بواسطة علم البلورات بالأشعة السينية. يدمج البروتوكول مجموعة من الطرق لتقييم تأثير المنظفات وdeglycosylation نوعيًا أثناء إعدادمركب رودوبسين -mini-G.o. وقد تبلور تبلور رودبسين في حالة غير نشطة وحالة تنشيط الضوء ملزمة مع وبدون الببتيد محول عند تنقيتها في المنظفات أوتيل جلوكوسيد (C8G)20،21،22 و C9G23،24. كما rhodopsin -mini-G-o مجمع تنقية في C8G و C9G لم تسفر عن بلورات (البيانات غير مبين)، ثم استكشفنا مجموعة واسعة من المنظفات الأخرى باستخدام استراتيجية وصفها(الشكل 1).o من خلال الاستفادة من حساسية الضوء من رودوبسين، يمكننا أن نتابع بشكل جيد جدا إعادة تكوين الشبكية في أطوال موجية أخرى من 280 نانومتر. في كل من التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس وSEC، اكتشفنا الشبكية إما في 380 نانومتر أو 488 نانومتر. ومع ذلك، فإن معظم البروتينات غشاء لم يكن لديك مثل الكروموفور مريحة لمتابعة وظيفة أثناء تنقية. الخيارات الأخرى هي جعل ليغاند يمكن الكشف عنها عن طريق إضافة كروموفور يمكن اكتشافه للضوء أو باستخدام الأشعة الملزمة والحرارية القابلة للتغير الحراري25.
رودوبسين لديه وزن جزيئي من 40 كيلو دا. نظرًا لكتلة المنظفات التي تربطها ، فإن وزنها الجزيئي الظاهر على SEC يبلغ حوالي 120 كيلو د. وبالتالي فإنه ليس من المستغرب أن الربط من مصغرة Gس (24 كيلو دا) لم يتم الكشف بسهولة على لجنة الأوراق المالية والبورصة، لأن هذا من شأنه أن يتطلب التمايز من البروتينات مع الجماهير الظاهرة من 120 كيلو دا و 144 كيلو دا. ولذلك استخدم تحليل كسور لجنة الأوراق المالية والبورصة من قبل SDS-PAGE لتأكيد نقاء العينة وتشكيل هامدة معقدة. حتى لو أظهرت ملفات تعريف SEC تحولًا واضحًا في التكوين المعقد ، فلا يزال من المستحسن إجراء تحليل SDS-PAGE لتأكيد التكوين المعقد مع شركاء الربط الصحيح بدلاً من الملوثات البروتينية الأخرى النقية.
تم تنقية كل من رودوبسين وميني جيس بكميات مليغرام ، مما سمح باستخدام الكشف عن الحساسية المنخفضة للمجمعات ، مثل امتصاص الأشعة فوق البنفسجية فيس أثناء SEC وCommassie Blue staining من المواد الهلامية SDS-PAGE. حيث تكون العينات محدودة ، يجب استخدام الكشف الأكثر حساسية ، مثل جهاز تنقية LC مجهز بكاشف فلوري لتتبع إشارات التربتوفان من البروتين (إثارة 280 نانومتر ، 350 نانومتر الانبعاثات) وتلطيخ الفضة للمواد الهلامية SDS-PAGE. وثمة نهج آخر يتمثل في دمج بروتين الفلورسنت، مثل بروتين الفلورسينس الأخضر (GFP) في البروتين ذي الأهمية، والذي من شأنه أن يسمح أيضا بالكشف حتى أثناء التعبير البروتيني26 ولكن ينبغي إزالته قبل التبلور.
من الضروري التأكد من أن البروتين المنقى خالي أيضًا من التغايرية الناشئة عن PTMs المتغير. في الحالة الموصوفة هنا ، تم وصف مجموعتين من رودوبسين لوحظ على المواد الهلامية SDS-PAGE بأنها إما واحدة أو اثنتين من N-glycans. تعديل متغير من البروتين من المحتمل أن تمنع تشكيل بلورات جيدا diffracting، لذلك نحن deglycosylated رودوبسين. وكان endoglycosidase إندو F1 تأثير اختبار وعلاج endoglycosidase أدى إلى نوع واحد من مستقبلات unglycosylated، في حين PNGase F إزالة جزئيا فقط جليكان على رودوبسين وأسفرت عن خليط من رودوبسين unglycosylated بالكامل أو مع واحد N-glycan بقيت. وقد تبلور تبلور بنجاح رودوبسين دون علاج deglycosylase3،27،28، وN – glycan على Rhodopsin Asn15 من المهم لتشكيل اتصال الكريستال في تلك الحالات. في حالة رودوبسين-ميني جيس،فمن الضروري إزالة N-glycans بواسطة إندو F1 للحصول على بلورات. لا توجد قاعدة موحدة لبروتينات deglycosylate ذات الأهمية قبل التبلور ، ولكن يجب النظر في إزالة PTMs غير متجانسة عندما تفشل البروتينات في التبلور بعد تجارب التبلور واسعة النطاق.
البيانات والمنهجية الموصوفة هنا ارشدتنا إلى اختيار OGNG باعتبارها المنظفات الأكثر تفضيلاo لبلورة rhodopsin-mini-G-O مجمع نظرا لصغر حجم micelle وقدرته على تحقيق الاستقرار في المجمع. كما استخدمنا إندو F1 لضمان أن يكون الرودوبسين المنقى من الأنواع المتجانسة. تم الحصول على بلورات في وقت لاحق وحددنا بنية الكريستال إلى ~ 3.1 Å4، الذي كان فقط الهيكل البلوري الثالث من بروتين GPCR-G يشير إلى مجمع14،29.
بالنسبة للبروتينات الغشائية المرتبطة ببروتين الشريك أو بدونه، يجب اعتبارها بروتينين مختلفين. البروتين في حالات وظيفية مختلفة لديه التشكيلات المختلفة وعلى مستوى الطاقة المختلفة. لذلك، فمن المستحسن لتحسين بروتوكول الإعداد لكل حالة وظيفية كما المعلمة لحالة غير نشطة قد لا تكون قابلة للتحويل بالكامل إلى الحالة المنشط. أيضا، ناهيك عن التغيير في خاصية البروتين معقدة عن طريق ربط بروتين شريك. يستخدم البروتوكول أساليب موحدة لإعداد عينة تبلور لإعداد بروتين الغشاء غير النشط في المنظفات المختلفة ، يليه تنشيط البروتين والتشكيل المعقد ، وتوصيف جودة البروتين. وبالتالي ، يمكن بسهولة تعميم هذا البروتوكول على بروتينات الأغشية الأخرى ومجمعاتها للدراسات الهيكلية مع تعديل طفيف.
The authors have nothing to disclose.
نشكر البروفيسور الدكتور غيبارد ف. س. شيرتلر على دعمه الطويل الأمد في هذا المشروع، الدكتور روجر ج. ب. داوسون وهوفمان لا روش على دعمهما في ثقافة الخلايا. وقد رعت هذا العمل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (المنح 210030_153145 310030B_173335 إلى GFXS)، والتمويل إلى CGT من مجلس البحوث الأوروبي (EMPSI، 339995) ومجلس البحوث الطبية (MRC U105197215). FP يعترف ETH Zürich من خلال المركز الوطني للكفاءة في البحوث الجزيئية فائقة السرعة العلوم والتكنولوجيا (NCCR MUST) وETH Femtosecond وAttosecond العلوم والتكنولوجيا (ETH FAST) . تعترف FP و JM و AB و CJT بالدعم المالي طويل الأجل من معهد بول شيرر.
1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
C9G | Anatrace | N324 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
DDM | Anatrace | D310 | |
DM | Anatrace | D322 | |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | – | |
LMNG | Anatrace | NG310 | |
Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
OGNG | Anatrace | NG311 | |
PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | – |