Denna rapport beskriver screening av olika rengöringsmedel för att förbereda den visuella GPCR, rhodopsin, och dess komplex med mini-Go. Biokemiska metoder som kännetecknar komplexets kvalitet i olika skeden under rening visas. Detta protokoll kan generaliseras till andra membran proteinkomplex för deras framtida strukturella studier.
Nyckeln till att bestämma kristallstrukturer av membranproteinkomplex är provets kvalitet före kristallisering. I synnerhet är valet av tvättmedel kritiskt, eftersom det påverkar både stabiliteten och monodispersity av komplexet. Vi fastställde nyligen kristallstrukturen hos ett aktivt tillstånd av bovin rhodopsin kopplat till ett konstruerat G-protein, mini-Go, vid 3.1 Å-upplösning. Här beskriver vi proceduren för att optimera beredningen av rhodopsin-mini-Go-komplexet. Dark-state rhodopsin var beredd i klassiska och neopentyl glykol (NPG) rengöringsmedel, följt av komplex bildning med mini-Go under ljusexponering. Stabiliteten i rhodopsin bedömdes av ultraviolett-synlig (UV-VIS) spektroskopi, som övervakar reconstitution i rhodopsin av ljuskänsliga ligand, 9-cis retinal. Automatiserad storlek-uteslutning kromatografi (SEC) användes för att karakterisera monodispersity av rhodopsin och rhodopsin-mini-Go komplex. SDS-polyakrylamid elektrofores (SDS-PAGE) bekräftade bildandet av komplexet genom att identifiera en 1:1 molar förhållandet mellan rhodopsin och mini-Go efter färgning gelen med Coomassie blå. Efter korsvalidering av alla dessa analysdata eliminerade vi olämpliga tvättmedel och fortsatte med det bästa datatvättmedlet för storskalig beredning och kristallisering. Ett ytterligare problem uppstod från heterogenitetn en N-glykosylering. Heterologously-uttryckt rhodopsin observerades på SDS-SIDA för att ha två olika N-glycosylated populationer, vilket förmodligen skulle ha hindrat kristalllogenesis. Därför testades olika deglycosylationenzymer, och endoglycosidase F1 (EndoF1) producerade rhodopsin med en enda art av N-glycosylation. Med denna strategiska pipeline för att karakterisera proteinkvalitet optimerades beredningen av rhodopsin-mini-Go-komplexet för att leverera kristallstrukturen. Detta var bara den tredje kristallstrukturen i en GPCR-G protein signalering komplex. Detta tillvägagångssätt kan också generaliseras för andra membranproteiner och deras komplex för att underlätta provberedning och strukturbestämning.
Bestämma kristall strukturer av membran proteiner och deras komplex har alltid varit utmanande på grund av svårigheter att få väl diffracting kristaller. I motsats till lösliga proteiner, integrerad membran proteiner utgör en hydrofoba kärna som spänner över cellmembranet. För att avlägsna membranproteiner från cellmembranet till vattenbuffert måste rengöringsmedel användas för att bilda en tvättmedelsproteinmicelle, vilket ersätter lipiderna runt membranproteinernas hydrofoba kärna. Membranproteiners stabilitet, aktivitet och integritet är direkt beroende av tvättmedlets kemiska och strukturella egenskaper1, och tvättmedlets egenskaper bestämmer också mikrofonellens storlek. En stor tvättmedel micelle kan ocklude hydrofila ytor av ett litet membran protein, vilket förhindrar kristallisering på grund av bristen på kristall kontakter när du använder ånga diffusion metod. En liten tvättmedel micelle är fördelaktigt för kristallografi, men kort kedja rengöringsmedel är oftast hårdare och därför leda till destabilisering och aggregering av membranproteinet. Därför, före kristallisering, en ytterligare tvättmedel screening förfarande är oumbärlig, vanligtvis riktar kortare rengöringsmedel som fortfarande upprätthålla proteinstabilitet.
G proteinkopplade receptorer (GPCRs) är integrerade membranproteiner som innehåller sju transmembran a-helices. GPCRs finns i två huvudstater, antingen ett inaktivt tillstånd stabiliserat av omvända agonister eller antagonister, eller ett aktivt tillstånd bundet till en agonist och stabiliseras av ett G-protein, även om det är troligt att en mängd delstater finns mellan dessa två ytterligheter. Struktur bestämning av GPCRs fokuserade ursprungligen på inaktiva tillstånd bundna till omvända agonister och antagonister på grund av deras högre stabilitet än aktiva stater2. När GPCRs aktiveras vid agonistbindning är receptorerna mycket dynamiska och en kluven bildas övergående på receptorns cytoplasmatiska ansikte för G-proteinkopplingen. Man tror att denna dynamik är anledningen till agonist-bundna GPCRs är ofta mer instabila än det inaktiva tillståndet. Därför blir det viktigt att skärmen för rengöringsmedel som är lämpliga för konformationstillståndet hos den receptor som studeras, eftersom det är troligt att mildare rengöringsmedel kommer att krävas för att studera ett aktivt tillstånd jämfört med ett inaktivt tillstånd.
I denna rapport använder vi den visuella GPCR, nötkreatur rhodopsin3, och dess komplex med mini-Go protein4,5 för tvättmedel screening experiment, som representerar inaktivt tillstånd och aktivt tillstånd, respektive. Tvättmedelsscreeningen fokuserade på de klassiska alkylmaltoside- och glukostvättmedelen och naopentylglykolstvättmedel (NPG). I detta sammanhang är ett klassiskt tvättmedel byggt från en sockerhuvudgrupp och en alkylkedja, medan NPG-typ tvättmedel innehåller två identiska klassiska rengöringsmedel som smälts av ett kvartärt kol i gränssnittet mellan socker och alkylkedjorna6,,7,8.
Ett experimentellt arbetsflöde utformades från rening av rhodopsin i olika rengöringsmedel, följt av bildandet av rhodopsin-mini-Go komplex och slutar med karakterisering av komplexet med flera metoder(bild 1). För det inaktiva tillståndet av rhodopsin övervakades reconstitution av den ljuskänsliga ligand9-cis retinal av ultraviolett-synlig (UV-VIS) spektroskopi. Spektrumet avslöjar det fysicokemiska tillståndet i retinal och är ett tecken på dess miljö i retinal bindande ficka av rhodopsin. Storlek utanförskap kromatografi (SEC) användes för att bedöma monodispersity av renade rhodopsin samt bildandet av rhodopsin-mini-Go komplex. Som SEC skiljer proteinmolekyler efter deras storlek och form, aggregerade proteinpopulationen kan identifieras som de elute i tomrummet volymen. För att bekräfta komplex bildning bedömdes fraktioner från SEC av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) för att bekräfta närvaron av både rhodopsin och mini-Go.
En annan faktor som måste beaktas är posttranslationella modifieringar (PTM) på membranproteinerna. PTM såsom N-glykosylering observeras ofta på eukaryota membranproteiner som produceras i däggdjurs- och insektscelluttryckssystem. En begränsad N-glykosylering stam av mänskliga embryonala njure 293 (HEK293) celler utvecklades genom radering av genen kodning N-acetylglukosaminyltransferas E I (GnTI), vilket resulterar i homogen N-glycosylation av GlcNAc2Man5 på konsensus plats Asn-X-Ser /Thr. Även n-glykosylering kan förebyggas genom att mutera en aminosyra rester i konsensus webbplats, Detta kan också förändra funktionen av proteinet eller effektiviteten i vikning. I nötkreatur rhodopsin, mutation av N-glycosylated rester Asn15 leder till felaktig vikning och minskad G protein aktivering9,10. Den rhodopsin som används i denna rapport uttrycktes i HEK 293 GnTI-bristfällig cellinje. SDS-PAGE visade dock närvaron av två arter av rhodopsin. Denna heterogenitet kan förhindra kristallbildning och därför deglycosylation med peptid-N-glycosidase F (PNGase F) och endoglycosidase F1 (Endo F1) testades. Den deglycosylated produkten kännetecknades av SDS-PAGE och flytande kromatografi-massa pektrometri (LC-MS) för att identifiera nivån av glycosylation och dess homogenitet.
Framgången i proteinkristallisering är starkt beroende av proteinprovet, särskilt membranproteiner och deras komplex på grund av den komplikation som orsakas av rengöringsmedel. Denna rapport visar tvättmedel screening och utvärdering av provkvalitet för GPCR-mini-G protein signalering komplex. En mängd olika metoder har använts i stor utsträckning för att studera den biokemiska egenskapen hos membranproteiner, till exempel termostabilitetsanalys med fluorescerande färgämnen16,,17, bindningsanalys för att upptäcka komplex bildning genom att mäta förändringen i tryptofanfluorescenssignal18 eller resonansenergiöverföringen med biosensorer19. De kemiska miljöer som används i dessa metoder skiljer sig dock helt från de för att förbereda ett kristalliseringsprov, antingen proteiner är på tusen gånger lägre koncentration för fluorescensbaserad mätning, eller proteiner bäddas in i lipidbilayers eller i ett fast tvättmedelstillstånd. I det här protokollet standardiseras de använda metoderna också i storskalig provberedning före kristallisering. Därför kan de optimerade parametrarna enkelt överföras för kristalliseringsskala förberedelse utan ytterligare större screening och optimering.
Syftet med detta protokoll är att optimera beredningen av ett stabilt och homogent GPCR-mini-G proteinkomplex för ångdiffusionskristallisering och strukturbestämning av röntgenkristallografi. Protokollet integrerar en uppsättning metoder för att kvalitativt utvärdera effekterna av tvättmedel och deglycosylation under beredningen av rhodopsin-mini-Go-komplexet. Rhodopsin vid inaktivt tillstånd och ljusaktiverat tillstånd bundet med och utan transducinpeptid har kristalliserats när renas i tvättmedel octyl glukosid (C8G)20,21,22 och C9G23,24. Som rhodopsin-mini-Go komplex renas i C8G och C9G inte gav kristaller (data visas inte), utforskade vi sedan ett bredare utbud av andra tvättmedel med hjälp av den strategi som beskrivs(figur 1). Genom att dra nytta av ljuskänslighetrhodopsin, kan vi mycket väl följa reconstitution av retinal vid våglängder än 280 nm. I både UV-VIS spektroskopi och SEC, upptäckte vi retinal på antingen 380 nm eller 488 nm. De flesta membranproteiner har dock inte en sådan bekväm kromofor att följa funktionaliteten under rening. Andra alternativ skulle vara att göra en ligand detekterbar genom att lägga till en ljus-detekterbar kromofor eller genom att använda radioligand-bindande och termiska skift analyser25.
Rhodopsin har en molekylvikt på 40 kDa. På grund av massan av tvättmedel det binder, dess uppenbara molekylvikt på SEC är ca 120 kDa. Det är därför ingen överraskning att bindningen av mini-Go (24 kDa) inte lätt upptäcktes på SEC, eftersom detta skulle kräva differentiering av proteiner med uppenbara massor av 120 kDa och 144 kDa. Analys av SEC-fraktioner av SDS-PAGE användes därför för att bekräfta provrenhet och komplex bildning. Även om SEC-profiler visar en tydlig förskjutning vid komplex bildning, rekommenderas det fortfarande att utföra SDS-PAGE-analys för att bekräfta den komplexa bildningen med korrekta bindningspartner snarare än andra co-purified proteinföroreningar.
Både rhodopsin och mini-Go renades i milligram mängder, vilket gjorde det möjligt att använda låg känslighet upptäckt av komplex, såsom UV-VIS absorption under SEC och Commassie Blue färgning av SDS-SIDA geler. Om proverna är begränsade bör känsligare detektion användas, såsom en LC-renare utrustad med en fluorescensdetektor för att spåra tryptofansignaler från proteinet (280 nm excitation, 350 nm emission) och silverfärgning för SDS-PAGE-geler. Ett annat tillvägagångssätt skulle vara att smälta ett fluorescerande protein, såsom grönt fluorescensprotein (GFP) till proteinet av intresse, vilket också skulle möjliggöra detektion även under proteinuttryck26 men det bör tas bort före kristallisering.
Det är viktigt att se till att det renade proteinet också är fritt från heterogenitet som härrör från varierande PTMs. I det fall som beskrivs här, de två populationer av rhodopsin observerats på SDS-SIDA geler karakteriserades som har antingen en eller två N-glykaner. Variabel modifiering av ett protein skulle potentiellt förhindra bildandet av väl diffracting kristaller, så vi därför deglycosylated rhodopsin. Endoglycosidase Endo F1 var den mest effekt endoglycosidase testade och behandling ledde till en enda art av unglycosylated receptor, medan PNGase F endast delvis bort glykanerna på rhodopsin och resulterade i en blandning av rhodopsin helt unglycosylated eller med en N-glycan kvar. Rhodopsin utan deglycosylase behandling har framgångsrikt kristalliseras3,27,28, och N-glycan på rhodopsin Asn15 är viktigt att bilda kristall kontakt i dessa fall. När det gäller rhodopsin-mini-Goär det nödvändigt att ta bort N-glykaner av Endo F1 för att få kristaller. Det finns ingen standardiserad regel att deglycosylate proteiner av intresse före kristallisering, men avlägsnande av heterogena PTMs bör övervägas när proteiner misslyckas med att kristallisera efter omfattande kristallisering prövningar.
De data och den metod som beskrivs här vägledde oss att välja OGNG som det mest föredragna tvättmedlet för kristallisering av rhodopsin-mini-Go-komplexet på grund av dess lilla micellestorlek och dess förmåga att stabilisera komplexet. Vi använde också Endo F1 för att säkerställa att renad rhodopsin var en homogen art. Kristaller erhölls därefter och vi bestämde kristallstrukturen till ~3.1 Å4, vilket bara var den tredje kristallstrukturen i ett GPCR-G proteinsignaleringskomplex14,29.
För membranproteiner bundna med och utan partnerprotein bör de betraktas som två olika proteiner. Ett protein i olika funktionella tillstånd har olika konformationer och ligger på olika energinivå. Därför rekommenderas att förbereda protokollet för varje funktionellt tillstånd som parameter för inaktivt tillstånd kanske inte är helt överförbar till det aktiverade tillståndet. För att inte heller tala om förändringen i proteinegenskapen kompliceras av att binda ett partnerprotein. Protokollet använder metoder som är standardiserade för att förbereda ett kristalliseringsprov för att förbereda inaktivt membranprotein i olika rengöringsmedel, följt av proteinaktivering och komplex bildning, och för att karakterisera proteinkvaliteten. Således kan detta protokoll lätt generaliseras till andra membranproteiner och deras komplex för strukturstudier med mindre modifiering.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar prof. Dr. Gebhard F. X. Schertler för hans långsiktiga stöd i detta projekt, Dr Roger J.P. Dawson och Hoffmann La Roche för stöd i cellkultur. Detta arbete sponsrades av Swiss National Science Foundation (bidrag 210030_153145 och 310030B_173335 till GFXS) och finansiering till CGT från Europeiska forskningsrådet (EMPSI, 339995) och Medical Research Council (MRC U105197215). FP erkänner ETH Zürich genom National Center of Competence in Research Molecular Ultrafast Science and Technology (NCCR MUST) och ETH Femtosecond och Attosecond Science and Technology (ETH FAST) program. FP, JM, AB och CJT erkänner långsiktigt ekonomiskt stöd från Paul Scherrer-institutet.
1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
C9G | Anatrace | N324 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
DDM | Anatrace | D310 | |
DM | Anatrace | D322 | |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | – | |
LMNG | Anatrace | NG310 | |
Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
OGNG | Anatrace | NG311 | |
PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | – |