Bu rapor, görsel GPCR, rodopsin ve mini-Goile karmaşık hazırlamak için farklı deterjanların tarama açıklar. Arınma sırasında kompleksin farklı aşamalarında kalitesini karakterize eden biyokimyasal yöntemler gösterilmiştir. Bu protokol gelecekteki yapısal çalışmaları için diğer membran protein komplekslerine genelleştirilebilir.
Membran protein komplekslerinin kristal yapılarını belirlemenin anahtarı kristalleşmeden önce numunenin kalitesidir. Özellikle deterjan seçimi önemlidir, çünkü kompleksin hem stabilitesini hem de monodispersitliğini etkiler. Yakın zamanda sığır rodopsinaktif bir devlet kristal yapısını tespit mühendislik G proteini ile birleştiğinde, mini-Go, 3.1 şçözünürlükte. Burada rodopsin-mini-Go kompleksinin hazırlanmasını optimize etme prosedürünü ayrıntılarıyla anlatacağız. Koyu hal rodopsin klasik ve neopentil glikol (NPG) deterjanlarda hazırlandı ve ardından ışık maruziyeti altında mini-Go ile karmaşık oluşum lar yapıldı. Rodopsin stabilitesi ultraviyole görünür (UV-VIS) spektroskopisi ile değerlendirildi, Hangi ışığa duyarlı ligand rodopsin içine reconstitution izler, 9-cis retinal. Rodopsin ve rodopsin-mini-Go kompleksinin monodispersitlüğünü karakterize etmek için otomatik boyut dışlama kromatografisi (SEC) kullanıldı. SDS-poliakrilamid elektroforezi (SDS-PAGE), jeli Coomassie mavisi ile boyandan sonra rodopsin ve mini-Go arasında 1:1 molar oranı belirleyerek kompleksin oluşumunu doğruladı. Tüm bu analitik verileri çapraz doğruladıktan sonra, uygun olmayan deterjanları ortadan kaldırdık ve büyük ölçekli hazırlık ve kristalizasyon için en iyi aday deterjanla devam ettik. N-glikozilasyonun heterojenliği nden kaynaklanan ek bir sorun daha ortaya çıkmıştır. Heterolog olarak ifade edilen rodopsin, SDS-PAGE’de iki farklı N-glikozilasyon popülasyonuna sahip olduğu gözlendi, bu da muhtemelen kristallogenezi engelledi. Bu nedenle, farklı deglikozilasyon enzimleri test edildi ve endoglycosidase F1 (EndoF1) N-glikozilasyon tek bir tür ile rodopsin üretti. Protein kalitesini niteleme amaçlı bu stratejik boru hattı ile rodopsin-mini-Go kompleksinin hazırlanması kristal yapıyı sağlamak için optimize edildi. Bu, GPCR-G protein sinyal kompleksinin sadece üçüncü kristal yapısıydı. Bu yaklaşım, numune hazırlama ve yapı tayinini kolaylaştırmak için diğer membran proteinleri ve kompleksleri için de genellenebilir.
Membran proteinlerinin ve komplekslerinin kristal yapılarının belirlenmesi, iyi yayılan kristallerin elde edilmesindeki güçlükler nedeniyle her zaman zor olmuştur. Çözünür proteinlerin aksine, integral membran proteinleri hücre zarını kapsayan hidrofobik bir çekirdek oluşturur. Hücre zarından sulu tampona membran proteinlerini çıkarmak için deterjanlar deterjan-protein mikelleri oluşturmak için kullanılmalı ve böylece membran proteinlerinin hidrofobik çekirdeğietrafındaki lipitlerin değiştirilmesi gerekir. Membran proteinlerinin stabilitesi, aktivitesi ve bütünlüğü doğrudan deterjan1’inkimyasal ve yapısal özelliklerine bağlıdır ve deterjan ın özellikleri de mikenin boyutunu belirler. Büyük bir deterjan micelle küçük bir membran proteininhidrofilik yüzeyleri tıkamak, böylece buhar difüzyon yöntemi kullanırken kristal temas eksikliği nedeniyle kristalizasyon önleyebilir. Küçük bir deterjan micelle kristalografi için avantajlıdır, ancak kısa zincirli deterjanlar genellikle daha serttir ve bu nedenle membran proteininin dengesinibozan ve toplanmasına yol açar. Bu nedenle, kristalizasyondan önce, ek bir deterjan tarama prosedürü vazgeçilmezdir, genellikle protein stabilitesini hala koruyan daha kısa deterjanları hedeflemek.
G protein-coupled reseptörleri (GpR) yedi transmembran a-helikler içeren integral membran proteinleridir. KPCR iki ana durumda var, ya ters agonistler veya antagonistler tarafından stabilize bir inaktif devlet, ya da aktif bir devlet bir agonist bağlı ve bir G protein tarafından stabilize, bu iki uç arasında çok sayıda alt devletler var olması muhtemeldir rağmen. GPCR yapı tayini başlangıçta aktif devletlere göre daha yüksek istikrar nedeniyle ters agonistler ve antagonistler bağlı inaktif devletler üzerinde duruldu2. KPCR agonist bağlama üzerine aktive edildiğinde, reseptörleri son derece dinamik, ve yarık g protein kaplin reseptörünün sitoplazmik yüzünde geçici olarak formları. Bu dinamizmin agonist bağlı GPCR’lerin genellikle aktif olmayan durumdan daha kararsız olmasının nedeni olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle, çalışma altındaki reseptörün konformasyonel durumuna uygun deterjanların taranması gerekli hale gelir, çünkü daha hafif deterjanların aktif bir durumu incelemek için inaktif bir duruma göre gerekli olması muhtemeldir.
Bu raporda, görsel GPCR, sığır rodopsin3ve mini-Go protein4,ile kompleks,5 deterjan tarama deneyleri için, inaktif durumu ve aktif durumu temsil, sırasıyla kullanın. Deterjan taraması klasik alkil maltoside ve glukoside deterjanlar ve neopentil glikol (NPG) deterjanları üzerinde duruldu. Bu bağlamda, klasik bir deterjan bir şeker kafa grubu ve alkil zinciri inşa edilir, NPG tipi deterjanlar şekerler ve alkil zincirleri arasındaki arayüz de kuaternary karbon tarafından erimiş iki özdeş klasik deterjan içerir iken6,7,8.
Farklı deterjanlarda rodopsinin arıtılmasından başlayarak deneysel bir iş akışı tasarlanmıştır, ardından rodopsin-mini-Go kompleksinin oluşumu ve kompleksin çeşitli yöntemlerle karakterizasyonu ile sona erdirilmiştir(Şekil 1). Rodopsinin inaktif durumu için ışığa duyarlı ligand 9-cis retinal reconstitution ultraviyole görünür (UV-VIS) spektroskopi ile izlendi. Spektrum retinanın fizikokimyasal durumunu ortaya çıkarır ve rodopsin retina bağlayıcı cebinde çevresinin göstergesidir. Arınmış rodopsinin monodispersitlüğünü ve rodopsin-mini-Go kompleksinin oluşumunu değerlendirmek için boyut dışlama kromatografisi (SEC) kullanılmıştır. SEC protein moleküllerini büyüklüklerine ve şekillerine göre farklılaştırırken, birleştirilmiş protein popülasyonu boşluk hacminde elat olarak tanımlanabilir. Karmaşık oluşumu doğrulamak için, SEC kesirler sodyum dodecyl sülfat-poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) hem rodopsin ve mini-Govarlığını doğrulamak için değerlendirildi .
Dikkate alınması gereken bir diğer faktör membran proteinleri üzerinde post-translational değişiklikler (PTM) olduğunu. N-glikozilasyon gibi PTM genellikle memeli ve böcek hücre ekspresyon sistemlerinde üretilen ökaryotik membran proteinlerinde gözlenmektedir. İnsan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücrelerinin sınırlı bir N-glikozilasyon suş n-asetilglucosaminyltransferaz I (GnTI) kodlayan genin silinmesi ile geliştirilmiştir, glcNAc2Man5 tarafından homojen N-glikozilasyon sonuçlanan asn-X-Ser/Thr. N-glikozilasyon konsensüs yerinde bir amino asit kalıntısı mutasyona uğratılması ile önlenebilir olsa da, bu da protein in işlevini veya katlama verimliliğini değiştirebilir. Büyükbaş rodopsinde, N-glikozile kalıntı Asn15 mutasyonu yanlış katlama ve azaltılmış G protein aktivasyonu yol açar9,10. Bu raporda kullanılan rodopsin HEK 293 GnTI eksikliği hücre hattında ifade edilebildi. Ancak, SDS-PAGE rodopsin iki tür varlığını gösterdi. Bu heterojenlik kristal oluşumunu engelleyebilir ve bu nedenle peptid-N-glikosidaz F (PNGase F) ve endoglycosidase F1 (Endo F1) kullanılarak deglikozilasyon test edildi. Deglikozilile ürün glikozilasyon düzeyini ve homojenliğini belirlemek için SDS-PAGE ve sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) ile karakterize edildi.
Protein kristalizasyonundaki başarı, deterjanların neden olduğu komplikasyon nedeniyle protein örneğine, özellikle membran proteinlerine ve komplekslerine bağlıdır. Bu rapor, GPCR-mini-G protein sinyal kompleksleri için deterjan taraması ve numune kalitesinin değerlendirilmesini göstermektedir. Çeşitli yöntemler yaygın membran proteinlerinin biyokimyasal özelliği ni incelemek için kullanılmıştır, örneğin, floresan boyalar kullanarak termostabilite tsay16,17, bağlayıcı teşbik triptofan floresan sinyali18 veya biyosensörler ile rezonans enerji transferi değişikliği ölçerek karmaşık oluşumunu tespit etmek için19. Ancak, bu yöntemlerde kullanılan kimyasal ortamlar bir kristalizasyon örneği hazırlamak için oldukça farklıdır, ya proteinler floresan bazlı ölçüm için bin kat daha düşük konsantrasyonda, ya da proteinler lipid iki katmanlı veya bir sabit deterjan durumda gömülüdür. Bu protokolde kullanılan yöntemler kristalizasyon dan önce büyük ölçekli numune hazırlamada da standartlaştırılmışolarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, optimize edilmiş parametreler daha fazla ana tarama ve optimizasyon olmadan kristalizasyon ölçeğinde hazırlık için kolayca aktarılabilir.
Bu protokolün amacı, x-ışını kristalografisi ile buhar difüzyon kristalizasyonu ve yapı tayini için istikrarlı ve homojen bir GPCR-mini-G protein kompleksinin hazırlanmasını optimize etmektir. Protokol, rodopsin-mini-Go kompleksinin hazırlanması sırasında deterjan ve deglikozilasyonun etkisini nitel olarak değerlendirmek için bir dizi yöntemi entegre eder. Rodopin inaktif durumda ve transdüsin peptid olmadan bağlı ve ışık aktive devlet deterjanlar octyl glukoside saflaştırılmış zaman kristalize edilmiştir (C8G)20,21,22 ve C9G23,24. C8G ve C9G’de saflaştırılan rodopsin-mini-Go kompleksi kristal leri verim vermedikçe (veriler gösterilmedi), daha sonra açıklanan stratejiyi kullanarak daha geniş bir diğer deterjan yelpazesini araştırdık (Şekil 1). Rodopsinin ışık hassasiyetinden yararlanarak retinanın 280 nm’den başka dalga boylarında yeniden yapılandırılabileceğini söyleyebiliriz. Hem UV-VIS spektroskopisinde hem de SEC’de retinal 380 nm veya 488 nm olarak saptın. Ancak, çoğu membran proteinlerinin arınma sırasında işlevselliği takip etmek için böyle uygun bir kromofor yok. Diğer seçenekler bir ışık tespit kromofor ekleyerek veya radyoligand-bağlayıcı ve termal vardiya tahlilleri25kullanarak bir ligand tespit edilebilir hale getirmek olacaktır.
Rodopsin in molekül ağırlığı 40 kDa’dır. Bağlaçdaki deterjan kütlesi nedeniyle SEC’deki molekül ağırlığı yaklaşık 120 kDa’dır. Bu nedenle mini-Go (24 kDa) bağlanmasının SEC’de kolayca tespit edilememesi şaşırtıcı değildir, çünkü bu proteinlerin belirgin kütleleri 120 kDa ve 144 kDa olan farklılaşmasını gerektirecektir. Bu nedenle SDS-PAGE ile SEC fraksiyonlarının analizi örnek saflığı ve karmaşık oluşumu doğrulamak için kullanılmıştır. SEC profilleri karmaşık oluşum üzerinde net bir kayma gösterse bile, karmaşık oluşumu diğer saflaştırılmış protein kirleticileri yerine doğru bağlama ortakları ile doğrulamak için SDS-PAGE analizinin gerçekleştirilmesi önerilir.
Hem rodopsin hem de mini-Go miligram miktarlarda saflaştırılmıştır, bu da sds-PAGE jellerinin SEC ve Commassie Blue boyama sı sırasında UV-VIS emilimi gibi komplekslerin düşük duyarlılık algılamasının kullanılmasını sağlamıştır. Numunelerin sınırlı olduğu durumlarda, proteinden gelen triptofan sinyallerini (280 nm uyarma, 350 nm emisyon) izlemek için floresan dedektörü ile donatılmış lc temizleyici ve SDS-PAGE jelleri için gümüş boyama gibi daha hassas algılama kullanılmalıdır. Başka bir yaklaşım bir floresan protein sigorta olacaktır, yeşil floresan protein gibi (GFP) ilgi protein, aynı zamanda protein ekspresyonu sırasında bile algılama sağlayacak26 ama kristalizasyon önce kaldırılmalıdır.
Saflaştırılmış proteinin değişken TBM’lerden kaynaklanan heterojenlikten de arındırılmış olmasını sağlamak esastır. Burada açıklanan durumda, SDS-PAGE jellerinde gözlenen iki rodopsin popülasyonu bir veya iki N-glikana sahip olarak karakterize edildi. Bir proteinin değişken modifikasyonu potansiyel olarak iyi dağılan kristallerin oluşumunu önler, bu nedenle rodopsinde deglikozilite. Endoglycosidase Endo F1 en etkili endoglycosidase test edildi ve tedavi unglycosylated reseptör tek bir tür yol açtı, PNGase F sadece kısmen rodopsin üzerinde glikan kaldırıldı ve rodopsin karışımı ile sonuçlanan tamamen unglycosileted veya bir N-glikan kaldı. Deglikozilaz tedavisi olmadan rodopin başarıyla kristalize olmuştur3,27,28, rodopsin Asn15 üzerinde N-glikan bu durumlarda kristal temas oluşturmak için önemlidir. Rodopsin-mini-Godurumunda, kristalleri elde etmek için Endo F1 ile N-glikanların çıkarılması gereklidir. Kristalizasyon dan önce ilgi deglikozilat proteinleri için standart bir kural yoktur, ancak proteinler kapsamlı kristalizasyon denemeleri sonra kristalize başarısız olduğunda heterojen PTM’lerin kaldırılması düşünülmelidir.
Burada açıklanan veri ve metodoloji, küçük micelle boyutu ve kompleksi stabilize etme yeteneği nedeniyle rodopsin-mini-Go kompleksinin kristalizasyonu için en çok tercih edilen deterjan olarak OGNG’yi seçmemize rehberlik etti. Ayrıca arıtılmış rodopsinin homojen bir tür olduğundan emin olmak için Endo F1’i kullandık. Kristaller daha sonra elde edildi ve biz ~ 3.1 ş4kristal yapısını belirledi , hangi bir GPCR-G protein sinyal kompleksi sadece üçüncü kristal yapısı oldu14,29.
Ortak proteinle bağlanan ve olmayan membran proteinleri için iki farklı protein olarak düşünülmelidir. Farklı fonksiyonel hallerde bir protein farklı konformasyonlara sahiptir ve farklı enerji düzeyindedir. Bu nedenle, etkin olmayan durum için parametre etkinleştirilen duruma tam olarak aktarılamaz gibi her işlevsel durum için hazırlama protokolü optimize etmek önerilir. Ayrıca, bir ortak protein bağlanarak karmaşık protein özelliği değişikliği söz değil. Protokol, farklı deterjanlarda inaktif membran proteini hazırlamak, ardından protein aktivasyonu ve kompleks oluşumunu sağlamak ve protein kalitesini karakterize etmek için kristalizasyon numunesi hazırlamak için standartlaştırılmış yöntemler kullanır. Böylece, bu protokol kolayca diğer membran proteinleri ve küçük değişiklikler ile yapısal çalışmalar için kompleksleri için genelleştirilmiş olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Prof. Dr. Gebhard F. X. Schertler’a bu projedeki uzun süreli desteği için teşekkür ederiz, Dr. Roger J.P. Dawson ve Hoffmann La Roche hücre kültürüne destek için. Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (210030_153145 ve 310030B_173335 GFXS’e hibe ler) ve Avrupa Araştırma Konseyi (EMPSI, 339995) ve Tıbbi Araştırma Konseyi’nden (MRC U105197215) CGT’ye fon sağlamak la desteklenmiştir. FP, ETH Zürich’i Ulusal Araştırma Yetkinlik Merkezi Moleküler Ultrafast Bilim ve Teknoloji (NCCR MUST) ve ETH Femtosecond ve Attosecond Science and Technology (ETH FAST) programları aracılığıyla kabul eder. FP, JM, AB ve CJT Paul Scherrer Enstitüsü’nden uzun vadeli mali destek kabul.
1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
C9G | Anatrace | N324 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
DDM | Anatrace | D310 | |
DM | Anatrace | D322 | |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | – | |
LMNG | Anatrace | NG310 | |
Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
OGNG | Anatrace | NG311 | |
PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | – |