מיפוי אופטי של הערכת החשמל לניתוחי לב באמצעות מתח כפול וסידן
Summary
פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור הנחת פרוסות לב של האדם לניסויים פרה-קליניים ופרטים השימוש במיפוי אופטי עבור הקלטת מתח טרנסממברניות ואותות סידן תאיים בו מפרוסות אלה.
Abstract
ההכנות לחיתוך לב האדם פותחו לאחרונה כפלטפורמה לחקר הפיזיולוגיה האנושית ובדיקות תרפיה לגשר על הפער בין בעלי חיים לניסויים קליניים. מודלים רבים של בעלי חיים ותאים שימשו כדי לבחון את ההשפעות של תרופות, אך תגובות אלה שונות לעתים קרובות אצל בני אדם. פרוסות לב אנושיות מציעות יתרון לבדיקת סמים בכך שהן נגזרות ישירות מלבבות אנושיים מעשי. בנוסף לשימור מבנים בעלי מבנה רב-תאי, צימוד תאים תאים וסביבות מטריצה ממסיביות, ניתן להשתמש בפרוסות של רקמת לב אנושית כדי לבדוק ישירות את ההשפעה של תרופות אין-ספור על פיזיולוגיה של לב האדם המבוגר. מה שמבדיל מודל זה מהכנות לב אחרות, כגון לבבות שלמים או פרוסות, היא שפרוסות יכולות להיות נתונים לתרבות ארוכת טווח. ככאלה, פרוסות לב מאפשרות ללמוד את ההשפעות החריפות והכרוניות של סמים. יתר על כן, היכולת לאסוף כמה מאות לאלף פרוסות מלב אחד הופך את זה מודל תפוקה גבוהה כדי לבדוק כמה תרופות בריכוזים שונים ושילובים עם סמים אחרים באותו זמן. פרוסות יכולות להיות מוכנות מכל אזור נתון בלב. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההכנה של פרוסות חדרית שמאלי על ידי בידוד קוביות רקמות מהקיר השמאלי של המוח החופשי ולהכניס אותם לפרוסות באמצעות מיקרו הרטט מדויק בדיוק גבוה. פרוסות אלה יכול להיות נתון לניסויים חריפים כדי למדוד פונקציה בסיסית אלקטרופיסיולוגית לב או תרבותי עבור לימודי סמים כרוניים. פרוטוקול זה מתאר גם מיפוי אופטי כפול של פרוסות לב עבור הקלטות בו זמנית של פוטנציאלים טרנסממברניים ודינמיקה סידן תאיים כדי לקבוע את ההשפעות של התרופות נחקר.
Introduction
דגמי בעלי חיים היו כלי רב ערך המשמש להבנת המנגנונים הבסיסיים של הפיזיולוגיה האנושית והפתופסולוגיה, כמו גם פלטפורמה לבדיקה ראשונית של טיפולים לטיפול במחלות שונות1. צעדים גדולים נלקחו בתחום המחקר הביו-רפואי המבוסס על לימודי בעלי חיים אלה2. עם זאת, הבדלים משמעותיים בין המינים קיימים בין הפיזיווגיות אנושיות ובעלי חיים, כולל עכברים, חולדות, שרקנים, ארנבים, כבשים, חזירים וכלבים3,4. כתוצאה מכך, היו הרבה תרופות, גנים, וטיפולים סלולריים שהראה הבטחה במהלך השלב בדיקות בעלי חיים, אך נכשל לחיות עד התוצאות בניסויים קליניים5. כדי לגשר על פער זה, לב מבודד מאוציטים ותאי גזע המושרה האדם pluriפוטנטי (iPSCs) פותחו כמודלים כדי לבדוק את התגובה של הפיזיולוגיה האנושית לתרופות ומחלות שונות6. תאי גזע מבוססי לב נגזר בשימוש נרחב במערכות עוגב-על-שבב כפונדקאית של הלב6,7,8. עם זאת, השימושיות של הקרדיוציטים הנגזרות (iPSC-CMs) מופרעת על ידי הפנוטיפים הילדותיים שלהם וחוסר ייצוג של אוכלוסיית הקרדיוומיציט; שריר הלב בוגרת הוא מבנה מורכב מורכב מספר סוגים של תאים הקיימים כגון פיברותקיעות, נוירונים, מקרופאגים, ותאי אנדותל. מצד שני, הקרדיוציטים האנושיים הבודדים הם בוגרים בחשמל, ואוכלוסיות שונות של הקרדיוציט ניתן להשיג על ידי שינוי פרמטרים של culturing9. עדיין, אלה מיוציטים בדרך כלל התערוכה משתנה פוטנציאל פעולה מורפולוגיות בשל העדר צימוד תא תא, מהיר בידול, והתרחשות של התנהגות proפרעות בחוץ מתורבת10,11. חלק מההגבלות טופלו על ידי מודלים של תרבות התא 3D של iPSC-CMs ומיציטים הלב. מודלים אלה, הכוללים spheroids, פיגום הידרוג’ל שעברו תרבויות תלת-ממד, מהונדסים רקמות לב (EHTs), ומערכות לב-על-שבב, להשתמש באוכלוסיות מרובות תאי לב כגון קרדיוטיציטים, פיברוטיטים ותאי אנדותל. הם או להרכיב או להרכיב לאורך פיגום ליצירת מבנים תלת ממדיים, וחלקם אפילו לשכפל את הטבע אניסוטרופי המורכב של שריר הלב. מודלים אלה דווחו להיות בעלי תאים של פנוטיפים בוגרים, מאפיינים כוללים, ופרופילים מולקולריים דומה לרקמת לב. מערכת הלב-על-שבב גם מאפשרת את המחקר של השפעות מערכתיות בבדיקות סמים ומחלות מודלים. עם זאת, במודלים מחוץ לגוף מתורבת חסר מטריצה החילוץ הילידים ולכן לא ניתן לחקות במדויק את האיברים האלקטרופיזיולוגיה ברמה האיבר. פרוסות לב של האדם, לעומת זאת, יש מטריצה ללא פגע ומקורי הקשר תא אל התא, מה שהופך אותם שימושיים לבדיקה מדויקת יותר של התכונות הקצב של שריר הלב האנושי.
חוקרים פיתחו פרוסות לב אנושי אורגנוטיפקס כפלטפורמה פיסיוקלינית פיזיולוגית עבור בדיקות תרופות חריפה וכרוניות וללמוד אלקטרופיזיולוגיה לב ומחלות לב התקדמות12,13,14,15,16,17,18,19. בהשוואה לקרדיוציטים הנגזרות iPSC, פרוסות לב האדם בנאמנות לשכפל בצורה מבוגרת אלקטרופיזיולוגיה לב האדם עם מתקן קרדיולוגי בוגר. כאשר בהשוואה לקרדיוציטים אנושיים בודדים, פרוסות לב התערוכה משכי הפוטנציאל של פעולה פיזיולוגית בגלל צימוד התא התא השתמר היטב את הקיום הפנימי של סביבות הפנים והמוגלות שלהם.
פרוטוקול זה מתאר את תהליך הפקת פרוסות לב האדם מלבבות תורמים שלמים, ביצוע אקוטי (כלומר, שעות ארוכות) וכרונית (כלומר, ימים ארוכים) לבדיקת פרמטרים של האלקטרופיזיולוגיה באמצעות מיפוי אופטי. בעוד פרוטוקול זה מתאר רק את השימוש של הרקמה השמאלית החדרית (LV), זה הוחל בהצלחה על אזורים אחרים של הלב, כמו גם מינים אחרים כגון עכברים, חולדות, חזירים גינאה, וחזירים14,20,21,22. המעבדה שלנו משתמשת לבבות תורמים שלמים שנדחו עבור ההשתלה במשך 5 השנים האחרונות, אבל זה אפשרי עבור אותם הליכים להיות מבוצעת על כל התורמים הלב לדוגמה רקמות שהתקבלו על ידי אמצעים חלופיים (למשל, שמאל חדרית לסייע המכשיר [LVAD] implantations, ביופסיות, myectomies כריתת המוח) כל עוד מיפוי אופטי מועסק לניתוח במחקר זה בשל יכולתו למפות בו זמנית את פוטנציאל הפעולה האופטי ואת ארעיות הסידן עם מרחבית גבוהה (100 x 100 פיקסלים) ו הזמני (> 1000 מסגרות/s) החלטה. ניתן להשתמש גם בשיטות חלופיות, כגון מערכים רב-אלקטרודה (אני) או מיקרואלקטרודות, אך טכניקות אלה מוגבלות ברזולוציות מרחבית נמוכות יחסית. בנוסף, אני נועדו לשימוש עם תרביות תאים, ומיקרואלקטרודות חדות מנוהלים בקלות רבה יותר לשימוש עם לבבות שלמים או ממדי רקמה גדולה.
מטרת המאמר היא לאפשר לחוקרים נוספים להשתמש ברקמות לב האדם למחקרים אלקטרופיזיולוגיה של הלב. יצוין כי הטכנולוגיה המתוארת במאמר זה היא פשוטה יחסית ומועילה למחקרים לטווח קצר (בסדר של מספר שעות עד ימים). תרבות פיזיולוגית ביותית יותר למחקרים לטווח ארוך (לפי סדר השבועות) נדונה ותוארה על ידי מספר מחקרים אחרים12,18,23. גירוי חשמלי, העמסה מכנית, ורקמות מתיחה הם מנגנוני מיזוג יתרון שיכולים לעזור להגביל את התחלתה של רקמות מחוץ לגופית שיפוץ12,18,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים שיטות צעד אחר צעד כדי לקבל פרוסות לב קיימא מן הלבבות עצר האדם לבבות ולאפיין פונקציונלית את הפרוסות באמצעות מיפוי אופטי כפול של פוטנציאל טרנסקרום וסידן תאיים. עם סביבה משומרת מועלת ומשולבת תאים תא התא, פרוסות לב האדם יכול לשמש כמודל מדויק של הלב האנושי לגילוי מדעי בסיסי וליע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון על ידי NIH (מענקים R21 EB023106, R44 HL139248, ו R01 HL126802), על ידי הקרן Leducq (הפרויקט קצב) ו מלגת האיגוד האמריקני פוסט דוקטורט (19POST34370122) הם הכירו בהכרת תודה.
Materials
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal – Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
- Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
- Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today’s translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
- Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).
- Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
- Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559 (2010).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117 (2019).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts – A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
- Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
- Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).
- Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721 (2019).
- George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
- Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).
- Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
- Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).
