Ontwikkeling van een Larval Zebrafish Infection Model voor Clostridioides difficile
Summary
Hier gepresenteerd is een veilige en effectieve methode om zebravissen larven te infecteren met fluorescerend gelabeldanaërobe C. difficile door micro-injectie en niet-invasieve microgavage.
Abstract
Clostridioides difficile infectie (CDI) wordt beschouwd als een van de meest voorkomende gezondheidszorg-geassocieerde gastro-intestinale infecties in de Verenigde Staten. De aangeboren immuunrespons tegen C. difficile is beschreven, maar de exacte rollen van neutrofielen en macrofagen in CDI zijn minder begrepen. In de huidige studie worden Danio rerio (zebravissen) larven gebruikt om een C. difficile infectiemodel vast te stellen voor beeldvorming van het gedrag en de samenwerking van deze aangeboren immuuncellen in vivo. Om C. difficilete controleren, is een etiketteringsprotocol met behulp van een fluorescerende kleurstof ingesteld. Een gelokaliseerde infectie wordt bereikt door micro-injecting gelabeld C. difficile, die actief groeit in de zebravissen darmkanaal en bootst de darmepitheel schade in CDI. Echter, dit directe infectie protocol is invasief en veroorzaakt microscopische wonden, die experimentele resultaten kunnen beïnvloeden. Daarom wordt hier een meer niet-invasief microgavageprotocol beschreven. De methode omvat de levering van C. difficile cellen rechtstreeks in de darm van zebravissen larven door intubatie via de open mond. Deze infectie methode bootst nauw de natuurlijke infectie route van C. difficile.
Introduction
C. difficile is een gram-positieve, spore-vormende, anaërobe en toxine-producerende bacillus dat is de belangrijkste oorzaak van ernstige infecties in het maag-darmkanaal1. Typische symptomen van CDI zijn diarree, buikpijn en fatale pseudomembranous colitis, en het kan soms leiden tot de dood1,2. Bewijs heeft aangetoond dat gastheer immuunreacties een cruciale rol spelen in zowel de progressie als de uitkomst van deze ziekte3. Naast de immuunrespons is de inheemse darmmicrobiota cruciaal voor het begin en de pathogenese van CDI4. In het afgelopen decennium zijn zowel het aantal gevallen als het sterftecijfer van CDI aanzienlijk toegenomen als gevolg van de opkomst van een hypervirulente stam van C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Een beter begrip van onderliggende immuunmechanismen en de rol van microbiota tijdens CDI zal helpen leiden tot nieuwe therapeutische ontwikkelingen en vooruitgang, waardoor deze epidemie beter kan worden onder controle.
Verschillende diermodellen, zoals de hamster en de muis, zijn ontwikkeld om inzicht te geven in de immuunverdediging tegen C. difficile7,8. Echter, de rol van aangeboren immuuncellen is nog steeds slecht begrepen, vooral omdat aangeboren immuuncel gedrag is voornamelijk afgeleid van histologische analyse of gekweekte cellen in vitro. Daarom zal het vaststellen van een transparant zebravismodel om de aangeboren immuunrespons op C. difficile binnenkant van een levend gewerveld organisme aan het licht te brengen, dergelijke studies vergemakkelijken. Zebravissen larven hebben een functioneel aangeboren immuunsysteem, maar ze missen het adaptieve immuunsysteem tot 4-6 weken na de bevruchting9. Deze unieke functie maakt zebravissenlarven een uitstekend model om de geïsoleerde respons en functie van aangeboren immuuncellen in CDI te bestuderen.
Dit rapport beschrijft nieuwe methoden met behulp van zebravissen larven om de interacties tussen C. difficile en aangeboren immuuncellen, zoals macrofagen en neutrofielen te bestuderen. Ten eerste wordt een gelokaliseerd micro-injectieprotocol gepresenteerd dat C. difficile inoculum en kleuring omvat. Met behulp van in vivo confocale time-lapse beeldvorming wordt de respons van neutrofielen en macrofagen op de infectieplaats geregistreerd en wordt de fagocytose van bacteriën door neutrofielen en macrofagen waargenomen. Er is echter gemeld dat de injectie zelf weefselschade veroorzaakt en leidt tot de aanwerving van leukocyten onafhankelijk van de bacterie10. Daarom wordt vervolgens een niet-invasief microgavageprotocol beschreven om C. difficile in de darm van zebravissenlarven te leveren. Eerdere studies hebben aangetoond dat inheemse gastro-intestinale microbiota een gastheer te beschermen tegen de kolonisatie van C. difficile11. Daarom worden gnotoötische zebravissenlarven ook gebruikt om de zebravis die besmet zijn 12vatbaar te maken. Daarna wordt darmdissectie uitgevoerd om levensvatbare C. difficile te herstellen en de duur van hun aanwezigheid in zebravissen darmkanaal te valideren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De gepresenteerde methoden wijzigen en breiden een bestaande aanpak uit om zebravissenlarven te infecteren door zowel injectie als microgavage10,14uit te voeren. Het toont ook een benadering aan om anaërobe ziekteverwekkers met zebravissenlarven te bestuderen22. Bovendien vergemakkelijkt het protocol de analyse van aangeboren immuuncelreacties in vivo op CDI en bij kolonisatie van C. difficile bij zebravissen. De methode is repro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn Timo Fritsch dankbaar voor uitstekende dierenverzorging. Wij danken de leden van de Köster en Steinert labs voor steun en nuttige discussies. We danken Dr. Dandan Han voor het kritisch lezen van het manuscript. Wij erkennen dankbaar de financiering van de deelstaat Nedersaksen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
References
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
- Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
- Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
- Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
- Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
- Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
- Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
- Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
- Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
- Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
- Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
- Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).
