Entwicklung eines Larval Zebrafish Infection Model für Clostridioides difficile
Summary
Präsentiert hier ist eine sichere und effektive Methode, um Zebrafischlarven mit fluoreszierend markierten anaeroben C. difficile durch Mikroinjektion und nichtinvasive Mikrogavage zu infizieren.
Abstract
Clostridioides difficile Infektion (CDI) gilt als eine der häufigsten Gesundheits-assoziierten Magen-Darm-Infektionen in den Vereinigten Staaten. Die angeborene Immunantwort gegen C. difficile wurde beschrieben, aber die genauen Rollen von Neutrophilen und Makrophagen in CDI sind weniger verstanden. In der aktuellen Studie werden Danio rerio (Zebrafisch) Larven verwendet, um ein C. difficile Infektionsmodell für die Abbildung des Verhaltens und der Zusammenarbeit dieser angeborenen Immunzellen in vivo zu etablieren. Zur Überwachung von C. difficilewurde ein Etikettierungsprotokoll mit einem Fluoreszenzfarbstoff eingerichtet. Eine lokalisierte Infektion wird durch Mikroinjektion mit der Bezeichnung C. difficile erreicht, die aktiv im Darmtrakt des Zebrafisches wächst und die Darmepithelschäden bei CDI imitiert. Dieses direkte Infektionsprotokoll ist jedoch invasiv und verursacht mikroskopische Wunden, die experimentelle Ergebnisse beeinflussen können. Daher wird hier ein nichtinvasiveres Mikrogavage-Protokoll beschrieben. Die Methode beinhaltet die Abgabe von C. difficile Zellen direkt in den Darm von Zebrafischlarven durch Intubation durch den offenen Mund. Diese Infektionsmethode imitiert eng den natürlichen Infektionsweg von C. difficile.
Introduction
C. difficile ist ein grampositiver, sporenbildender, anaerobeundischer und toxinproduzierender Bacillus, der die Hauptursache für schwere Infektionen im Magen-Darm-Traktist 1. Typische Symptome von CDI sind Durchfall, Bauchschmerzen und tödliche pseudomembranöse Kolitis, und es kann manchmal zum Tod führen1,2. Es gibt Beweise dafür, dass Immunantworten des Wirts eine entscheidende Rolle sowohl für das Fortschreiten als auch für das Ergebnis dieser Krankheit spielen3. Neben der Immunantwort ist die einheimische Darmmikrobiota entscheidend für den Beginn und die Pathogenese von CDI4. In den letzten zehn Jahren haben sowohl die Zahl der Fälle als auch die Sterblichkeitsrate von CDI aufgrund der Entstehung eines hypervirulenten Stammes von C. difficile (BI/NAP1/027)5,6signifikant zugenommen. Ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Immunmechanismen und der Rolle der Mikrobiota während der CDI wird zu neuen therapeutischen Entwicklungen und Fortschritten führen und eine bessere Bekämpfung dieser Epidemie ermöglichen.
Mehrere Tiermodelle, wie Hamster und Maus, wurden entwickelt, um Einblicke in die Immunabwehr gegen C. difficile7,8zu geben. Die Rolle angeborener Immunzellen ist jedoch noch immer wenig verstanden, zumal das angeborene Verhalten von Immunzellen hauptsächlich aus histologischer Analyse oder kultivierten Zellen in vitro abgeleitet wird. Daher wird die Einrichtung eines transparenten Zebrafischmodells, um die angeborene Immunantwort auf C. difficile innerhalb eines lebenden Wirbeltierorganismus zu enthüllen, solche Studien erleichtern. Zebrafischlarven haben ein funktionelles angeborenes Immunsystem, aber ihnen fehlt das adaptive Immunsystem bis 4-6 Wochen nach der Befruchtung9. Diese einzigartige Eigenschaft macht Zebrafischlarven zu einem ausgezeichneten Modell, um die isolierte Reaktion und Funktion angeborener Immunzellen in CDI zu untersuchen.
Dieser Bericht beschreibt neue Methoden mit Zebrafischlarven, um die Wechselwirkungen zwischen C. difficile und angeborenen Immunzellen, wie Makrophagen und Neutrophilen, zu untersuchen. Zunächst wird ein lokalisiertes Mikroinjektionsprotokoll vorgestellt, das C. difficile Inoculum und Färbung enthält. Mit in vivo konfokale Zeitraffer-Bildgebung wird die Reaktion von Neutrophilen und Makrophagen auf die Infektionsstelle aufgezeichnet, und die Phagozytose von Bakterien durch Neutrophile und Makrophagen wird beobachtet. Es wurde jedoch berichtet, dass die Injektion selbst Gewebeschäden verursacht und zur Rekrutierung von Leukozyten unabhängig von den Bakterienführt 10. Daher wird anschließend ein nichtinvasives Mikrogavage-Protokoll beschrieben, um C. difficile in den Darm von Zebrafischlarven zu liefern. Frühere Studien haben gezeigt, dass einheimische gastrointestinale Mikrobiota einen Wirt vor der Kolonisierung von C. difficile11schützen. Daher werden gnotobiotische Zebrafischlarven auch verwendet, um die Zebrafische, die infiziert sind, zu prädisponieren 12. Danach wird die Darmsektion durchgeführt, um lebensfähige C. difficile zu erholen und die Dauer ihrer Anwesenheit in Zebrafisch-Darmtrakten zu validieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorgestellten Methoden modifizieren und erweitern einen bestehenden Ansatz zur Infektion von Zebrafischlarven durch Injektion und Mikrogavage10,14. Es zeigt auch einen Ansatz zur Untersuchung anaerobe Krankheitserreger mit Zebrafischlarven22. Darüber hinaus erleichtert das Protokoll die Analyse angeborener Immunzellreaktionen in vivo nach CDI und nach Deronisation von C. difficile bei Zebrafischen. Die Methode ist reproduzier…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Timo Fritsch für die hervorragende Tierpflege. Wir danken den Mitgliedern der Labore Köster und Steinert für die Unterstützung und die hilfreichen Gespräche. Wir danken Dr. Dandan Han für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken der Finanzierung durch das Land Niedersachsen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
References
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