결합된 조건부 녹다운 및 적응된 구체 형성 분석은 환자 유래 위암 줄기 세포의 줄기 관련 유전자를 연구하기 위하여
Summary
이 프로토콜에서, 우리는 조건부 녹다운 시스템과 환자 유래 GCSCs의 줄기에 대한 클러스터진의 효과를 연구하기 위해 적응된 구 형성 분석서를 사용하여 실험 설계를 제시한다. 프로토콜은 CSC의 다른 모형에 있는 줄기 관련 유전자의 체외 및 생체 내 기능 둘 다 공부하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.
Abstract
암 줄기 세포 (CSC)는 종양 개시, 발달 및 치료 후 재발에 연루되어 있으며 지난 수십 년 동안 많은 연구의 관심의 중심이되었습니다. 따라서 암세포 줄기에 관여하는 주요 유전자의 역할을 조사하는 방법을 개발하는 것이 중요하다. 위암 (GC)은 암의 가장 일반적이고 필멸의 모형 의 한개입니다. 위암 줄기세포(GCSC)는 위암 재발, 전이 및 약물 내성의 근본원인것으로 생각된다. GCSCs 생물학을 이해하는 것은 표적으로 한 치료의 발달을 발전시키고 결국 환자 중 사망을 감소시키기 위하여 필요합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 조건부 녹다운 시스템과 환자 유래 GCSCs의 줄기에 대한 클러스터진의 효과를 연구하기 위해 적응된 구 형성 분석서를 사용하여 실험 설계를 제시한다. 프로토콜은 CSC의 다른 모형에 있는 줄기 관련 유전자의 체외 및 생체 내 기능 둘 다 공부하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.
Introduction
위암 (GC)은 암의 가장 일반적이고 필멸의 유형 중 하나입니다1. 결합된 수술, 화학요법 및 GC 치료에 있는 방사선 요법에 있는 어드밴스에 도 불구하고, 예후는 가난한 남아 있고 5 년 생존율은 아직도 아주 낮은2입니다. 재발과 전이는 치료 후 사망을 일으키는 주된 이유입니다.
암줄기세포(CSC)는 종양3을재구성하는 상이한 세포 계보를 자가 갱신하고 생성하는 능력을 가진 암세포의 하위 집합이다. CSC는 자기 갱신 및 파종 새로운 종양의 그들의 기능 때문에 암 재발및 전이에 책임 있는 것으로 믿어진다, 전통적인 화학 요법및 방사선요법4에그들의 저항뿐만 아니라. 따라서 CSC를 타겟팅하고 CSC를 제거하면 치료를 개선하고 암 환자의 사망률을 줄일 수있는 흥미로운 잠재력을 제공합니다.
CSC는 고형 종양5의많은 모형에서 격리되었습니다. 2009년, 인간 위암 세포로부터 분리된 위암 줄기세포(GCSCs)는 원래 타카이시 외6에의해 기술되었다. 첸과 동료들은 인간 위 성암(GAC) 종양 조직7으로부터GCSC를 먼저 확인하고 정제하였다. 이 사실 인정은 GCSCs 생물학을 공부하는 기회를 제공할 뿐만 아니라 또한 중대한 임상 중요성을 제공합니다.
CSC의 특정 특성은 구8을형성하는 능력입니다. 단일 세포는 저밀도에서 비부착 조건에서 도금되며, 자체 갱신을 소유한 세포만이 구라고 불리는 고체, 구형 클러스터로 성장할 수 있다. 따라서, 구형성 분석은 금본위제 분석으로 간주되어 왔으며, 시험관내에서 줄기세포 자가재생 잠재력을 평가하기 위해 널리 사용되고 있다.
RNA 간섭(RNAi)은 특정 유전자9의녹다운에 의해 유전자 기능을 연구하는 강력한 연구 도구이다. 그러나, 장기 안정유전자 녹다운 기술은 세포 생존에 필수적인 유전자의 기능을 탐구하는 도전과 같은 특정 한계가 있습니다. 조건부 RNAi 시스템은 유도제의 투여에 의한 시간적 및/또는 특수 제어 방식으로 원하는 유전자의 하향 조절에 유용할 수 있다. 테트라사이클린(Tet)-유도 할 수 없는 시스템은 가장 널리 사용되는 조건부 RNAi시스템(10)중 하나입니다. Tet 유도성 시스템은 외인 유도제(우선 독시사이클린, 독스)를 첨가하면 shRNA의 발현을 제어함으로써 표적 유전자 침묵을 유도할 수 있다. Tet-유도 할 수없는 시스템은 Tet-On 또는 Tet-Off 시스템의 두 가지 유형으로 나눌 수 있습니다. shRNA의 발현은 유도체의 존재에서 켜지거나 (Tet-Off) 끌 수 있다. 유도체가 없는 Tet-ON 시스템에서, 구성적으로 발현된 Tet 억압기(TetR)는 스텐반응요소(TRE) 서열에 결합하여 shRNA 발현을 위한 테트 반응폴 III 의존성 프로모터를 함유하여 shRNA 발현을 억압한다. Dox가 추가되면 TetR은 Tet 반응폴 III 의존성 프로모터로부터 격리됩니다. 이것은 shRNA의 발현을 용이하게하고 유전자 녹다운으로 이끌어 냅니다.
여기서 설명된 프로토콜은 환자 유래 GCSCs에서 클러스터진의 기능을 연구하기 위해 기능적인 테트라사이클린 유도성 shRNA 시스템과 적응된 구체 형성 분석서를채택하였다. 설명된 프로토콜을 사용하여 GCSC 자체 갱신에서 클러스터진의 효과를 연구합니다. 이 방법론은 암 줄기 세포의 그밖 모형에도 적용됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
GC는 전 세계적으로 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인입니다. GCSC는 위암 재발, 전이 및 약물 내성에서 매우 중요합니다. 위암 환자로부터 GCSC를 사용하면 약점을 탐구하고 GC 환자의 치료를위한 표적 약물을 개발할 수 있습니다.
구형성 분석법은 체외에서 암 줄기세포 자가재생 잠재력을 검사하는 유용한 방법이다. 결과는 시드된 단일 세포의 원래 수로 나눈 구체의 백분율로 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 광동성 자연과학재단(2018A030310586, 2020A1515010989), 광동성 의학과학재단(A2019405)이 후원했습니다. 중국(81772957), 중국 광동성 과학기술프로그램(2017B03030101016), 심천산업정보기술재단(201803091010135860).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
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