Derribo condicional combinado y ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar un gen asociado a la stemness de células madre de cáncer gástrico derivadas del paciente
Summary
En este protocolo, presentamos un diseño experimental utilizando un sistema de derribo condicional y un ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar el efecto de clusterin en el tallo de los GCSC derivados del paciente. El protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar la función in vitro e in vivo de genes asociados a la stemness en diferentes tipos de CSC.
Abstract
Las células madre cancerosas (CSC) están implicadas en la iniciación, el desarrollo y la recurrencia de tumores después del tratamiento, y se han convertido en el centro de atención de muchos estudios en las últimas décadas. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos para investigar el papel de los genes clave involucrados en el tallo de las células cancerosas. El cáncer gástrico (GC) es uno de los tipos de cáncer más comunes y mortales. Se cree que las células madre del cáncer gástrico (GCSC) son la raíz de la recaída del cáncer gástrico, la metástasis y la resistencia a los medicamentos. Comprender la biología de los GCSC es necesario para avanzar en el desarrollo de terapias dirigidas y eventualmente para reducir la mortalidad entre los pacientes. En este protocolo, presentamos un diseño experimental utilizando un sistema de derribo condicional y un ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar el efecto de clusterin en el tallo de los GCSC derivados del paciente. El protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar la función in vitro e in vivo de genes asociados a la stemness en diferentes tipos de CSC.
Introduction
El cáncer gástrico (GC) es uno de los tipos de cáncer más comunes y mortales1. A pesar de los avances en la cirugía combinada, la quimioterapia y la radioterapia en la terapia de GC, el pronóstico sigue siendo pobre y la tasa de supervivencia de cinco años sigue siendo muy baja2. La recurrencia y la metástasis son las principales razones por las que las muertes después del tratamiento.
Las células madre cancerosas (CSC) son un subconjunto de células cancerosas que poseen la capacidad de autorre renovarse y generar los diferentes linajes celulares que reconstituyen el tumor3. Se cree que las CSC son responsables de la recaída del cáncer y la metástasis debido a sus capacidades de auto-renovación y siembra de nuevos tumores, así como su resistencia a las quimios y radioterapias tradicionales4. Por lo tanto, la orientación a las CSC y la eliminación de las CSC proporcionan un potencial emocionante para mejorar el tratamiento y reducir la mortalidad de los pacientes con cáncer.
Los CSC se han aislado de muchos tipos de tumores sólidos5. En 2009, las células madre de cáncer gástrico (GCSC) aisladas de las líneas celulares de cáncer gástrico humano fueron descritas originalmente por Takaishi et al.6. Chen y sus colegas identificaron y purificaron en primer lugar los GCSC a partir de tejidos tumorales de adenocarcinoma gástrico humano (GAC)7. Estos hallazgos no sólo proporcionan una oportunidad para estudiar la biología de los GCSC, sino que también proporcionan una gran importancia clínica.
Una característica particular de las CSC es su capacidad para formar una esfera8. Las células individuales se chapan en condiciones no adherentes a baja densidad, y solo las células poseídas con la auto-renovación pueden crecer hasta convertirse en un grupo sólido y esférico llamado esfera. Por lo tanto, el ensayo de formación de la esfera ha sido considerado como el ensayo estándar de oro y ampliamente utilizado para evaluar el potencial de auto-renovación de células madre in vitro.
La interferencia de ARN (ARNi) es una poderosa herramienta de investigación para estudiar la función genética mediante el derribo de un gen específico9. Sin embargo, las tecnologías de derribo de genes estables a largo plazo tienen ciertas limitaciones, como el desafío de explorar la función de un gen que es esencial para la supervivencia celular. Los sistemas de ARNi condicional pueden ser útiles para la regulación descendente de los genes deseados de manera temporal y/o controlada especial por la administración de un agente inductor. Los sistemas inducibles de tetraciclina (Tet) son uno de los sistemas de ARNi condicional más utilizados10. Los sistemas inducibles Tet pueden inducir el silenciamiento del gen diana controlando la expresión de ARNh tras la adición de un inductor exógeno (preferentemente doxiciclina, Dox). Los sistemas inducibles Tet se pueden dividir en dos tipos: sistemas Tet-On o Tet-Off. La expresión de arnesco se puede activar (Tet-On) o desactivarla (Tet-Off) en presencia del inductor. En el sistema Tet-ON sin un inductor, el represor Tet (TetR) expresa constitutivamente se une a la secuencia del elemento sensible al Tet (TRE) que contiene un promotor dependiente de Pol III sensible a Tet para la expresión de ARNH, reprimiendo así la expresión del arnesón. Mientras que después de la adición de Dox, el TetR es secuestrado lejos del promotor dependiente de Pol III con respuesta tet. Esto facilita la expresión del ARNN y conduce a la reducción genética.
El protocolo descrito aquí emplea un sistema funcional de ARNN inducible de tetraciclina y un ensayo de formación de esferas adaptada para estudiar la función de clusterin en GCSC derivados del paciente. Clusterin ha sido identificado como una nueva molécula clave para mantener el tallo y la supervivencia de los GCSC en un estudio anterior11. Utilizamos el protocolo descrito para estudiar los efectos de clusterin en la auto-renovación de GCSC. Esta metodología también es aplicable a otros tipos de células madre cancerosas.
Protocol
Representative Results
Discussion
GC es la tercera causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. Los GCSC son críticos en la recaída del cáncer gástrico, la metástasis y la resistencia a los medicamentos. El uso de GCSC de pacientes con cáncer gástrico nos permitirá explorar su punto débil y desarrollar los medicamentos de orientación para el tratamiento de pacientes con GC.
El ensayo de formación de la esfera es un método útil para examinar el potencial de auto-renovación de células madre cancero…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias de la Naturaleza de la Provincia de Guangdong (2018A030310586, 2020A1515010989), la Fundación de Investigación Científica Médica de la provincia de Guangdong (A2019405), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81772957), la Science y Programa de Tecnología de la Provincia de Guangdong en China (2017B030301016), y la Fundación de Industria y Tecnología de la Información de Shenzhen (20180309100135860).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
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