Ensaio de formação de esferas condicionais combinadas e ensaio de formação de esfera adaptada para estudar um gene associado à haste de células-tronco de câncer gástrico derivados do paciente

Summary

Neste protocolo, apresentamos um projeto experimental utilizando um sistema de knockdown condicional e um ensaio de formação de esfera adaptada para estudar o efeito da clusterina na haste dos GCSCs derivados do paciente. O protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tanto a função in vitro quanto in vivo de genes associados à haste em diferentes tipos de CSCs.

Abstract

As células-tronco cancerígenas (CSCs) estão implicadas na iniciação, desenvolvimento e recidiva do tumor após o tratamento, e tornaram-se o centro de atenção de muitos estudos nas últimas décadas. Por isso, é importante desenvolver métodos para investigar o papel dos genes-chave envolvidos na haste celular cancerosa. O câncer gástrico (GC) é um dos tipos mais comuns e mortais de câncer. Acredita-se que as células-tronco do câncer gástrico (GCSCs) sejam a raiz da recaída do câncer gástrico, da metástase e da resistência a medicamentos. A compreensão da biologia dos GCSCs é necessária para avançar no desenvolvimento de terapias-alvo e, eventualmente, reduzir a mortalidade entre os pacientes. Neste protocolo, apresentamos um projeto experimental utilizando um sistema de knockdown condicional e um ensaio de formação de esfera adaptada para estudar o efeito da clusterina na haste dos GCSCs derivados do paciente. O protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tanto a função in vitro quanto in vivo de genes associados à haste em diferentes tipos de CSCs.

Introduction

O câncer gástrico (GC) é um dos tipos mais comuns e mortais de câncer¹. Apesar dos avanços na cirurgia combinada, quimioterapia e radioterapia na terapia GC, o prognóstico permanece ruim e a taxa de sobrevivência de cinco anos ainda é muito baixa². A recidiva e a metástase são as principais razões que causam as mortes pós-tratamento.

As células-tronco cancerígenas (CSCs) são um subconjunto de células cancerígenas que possuem a capacidade de se auto-renovar e gerar as diferentes linhagens celulares que reconstituem o tumor³. Acredita-se que os CSCs sejam responsáveis pela recaída do câncer e pela metástase devido às suas capacidades de autoconexão e semeadura de novos tumores, bem como sua resistência à quimioterapia e radioterapias tradicionais⁴. Portanto, direcionar CSCs e eliminar CSCs fornecem um potencial empolgante para melhorar o tratamento e reduzir a mortalidade de pacientes com câncer.

Os CSCs foram isolados de muitos tipos de tumores sólidos⁵. Em 2009, células-tronco de câncer gástrico (GCSCs) isoladas das linhas celulares de câncer gástrico humano foram originalmente descritas por Takaishi et al.⁶. Chen e colegas primeiro identificaram e purificaram GCSCs de tecidos tumorais de adenocarcinoma gástrico humano (GAC)⁷. Esses achados não apenas proporcionam uma oportunidade de estudar biologia dos GCSCs, mas também fornecem grande importância clínica.

Uma característica particular dos CSCs é sua capacidade de formar uma esfera⁸. Células únicas são banhadas em condições nãoadherentes em baixa densidade, e apenas as células possuídas com auto-renovação podem crescer em um aglomerado sólido e esférico chamado esfera. Assim, o ensaio de formação da esfera tem sido considerado como o ensaio padrão-ouro e amplamente utilizado para avaliar o potencial de auto-renovação das células-tronco in vitro.

A interferência de RNA (RNAi) é uma poderosa ferramenta de pesquisa para estudar a função genética pela derrubada de um gene específico⁹. No entanto, tecnologias de knockdown de genes estáveis de longo prazo têm certas limitações, como o desafio de explorar a função de um gene que é essencial para a sobrevivência celular. Sistemas RNAi condicional podem ser úteis para a baixa regulação dos genes desejados de forma temporal e/ou especial controlada pela administração de um agente indutor. Os sistemas induutíveis tetraciclina (Tet) são um dos sistemas condicionais mais utilizados¹⁰. Os sistemas indutíveis de Tet podem induzir o silenciamento genético alvo controlando a expressão de shRNA após a adição de um indutor exógeno (preferencialmente doxiciclina, Dox). Os sistemas indutíveis do Tet podem ser divididos em dois tipos: sistemas Tet-On ou Tet-Off. A expressão de shRNA pode ser ligada (Tet-On) ou desligada (Tet-Off) na presença do indutor. No sistema Tet-ON sem um indutor, o repressor Tet (TetR) expresso constitutivamente se liga à sequência de elementos tet-responsivo (TRE) contendo um promotor dependente pol III sensível ao Tet para expressão de shRNA, reprimindo assim a expressão do shRNA. Enquanto, após a adição de Dox, o TetR é sequestrado longe do promotor dependente de Pol III. Isso facilita a expressão do shRNA e leva ao knockdown genético.

O protocolo descrito aqui emprega um sistema de shRNA indutível de tetraciclina funcional e um ensaio de formação de esfera adaptada para estudar a função de clusterin em GCSCs derivados do paciente. Clusterin foi identificado como uma molécula-chave nova para manter a hasteza e a sobrevivência dos GCSCs em um estudo anterior¹¹. Utilizamos o protocolo descrito para estudar os efeitos da clusterina na auto-renovação dos GCSCs. Essa metodologia também é aplicável a outros tipos de células-tronco cancerígenas.

Protocol

Todas as experimentações utilizando células-tronco de câncer gástrico derivadas do paciente descritas aqui foram aprovadas pelo comitê de ética local7. 1. Cultura de células-tronco do câncer gástrico Preparação de GCSCs meio de cultura completa Prepare os GCSCs meio de cultura completa adicionando meio DME/F12 fresco com os seguintes ingredientes essenciais: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% Insulina/Transferrin/Selenita de sódio, 0,2% de gl…

Representative Results

As células-tronco do câncer gástrico do adenocarcinoma gástrico primário foram cultivadas em meio de cultura livre de soro. Após 6 dias, as células se expandiram do fenótipo de célula única(Figura 1A)para formar grandes esferas(Figura 1B). Para avaliar a função de clusterin em GCSCs, sequências de shRNA contra clusterin e m…

Discussion

GC é a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Os GCSCs são críticos na recaída do câncer gástrico, metástase e resistência a medicamentos. O uso de GCSCs de pacientes com câncer gástrico nos permitirá explorar seu ponto fraco e desenvolver os medicamentos direcionados para o tratamento de pacientes com GC.

O ensaio de formação de esferas é um método útil para examinar o potencial de auto-renovação das células-tronco do câncer in vitro. Os …

Materials

0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
2-Mercaptoethanol	Gibco	2068586
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate	Gibco	10569044
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190250
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia	Gibco	10099141
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061
Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X	Gibco	41400045
lentiviral vector	GeneChem	GV307
Lenti-X Concentrator	Takara	631232
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	Gibco	11140050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLHV033RB
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes	Thermo Scientific	5000-1020
Nunc Cell Culture/Petri Dishes	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
pHelper 1.0 (gag/pol component)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (VSVG component)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase Cell Dissociation Solution	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5	Invitrogen	15567027
ZEISS Inverted Microscope	ZEISS	Axio Vert.A1