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Developmental Biology

दंत लुगदी पैराक्रिन सिग्नल के जवाब में न्यूराइट आउटग्रोथ का अध्ययन करने के लिए एक सह-संस्कृति विधि

Published: February 14, 2020 doi: 10.3791/60809
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cell, Developmental and Integrative Biology Department, University of Alabama at Birmingham

Summary

हम ट्राइजेमिनल (टीजी) न्यूरॉन्स के साथ दंत लुगदी (डीपी) प्राथमिक कोशिकाओं के अलगाव, फैलाव और चढ़ाना का वर्णन करते हैं जो ओवरलाइंग ट्रांसवेल फिल्टर के ऊपर सुसंस्कृत हैं। डीपी कोशिकाओं की सेलुलर प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण प्रतिरक्षण या आरएनए/प्रोटीन विश्लेषण के साथ किया जा सकता है । कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ न्यूरोनल मार्कर की इम्यूनोफ्लोरेसेंस न्यूराइट आउटग्रोथ प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण की अनुमति देता है।

Abstract

दांत अंतरावण दांतों को दबाव, तापमान और सूजन को समझने की अनुमति देता है, जो सभी दांत के अंग के उपयोग और रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण हैं। संवेदी अंतरावण के बिना, दैनिक मौखिक गतिविधियों अपूरणीय क्षति का कारण होगा। इसके महत्व के बावजूद, दांत विकास और रखरखाव में अंतरावता की भूमिकाओं को काफी हद तक अनदेखा किया गया है । कई अध्ययनों से पता चला है कि डीपी कोशिकाओं को आकर्षित करने और दांत भर में टीजी एक्सन गाइड करने के लिए एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन और पैराक्रिन संकेतों स्राव । हालांकि, कुछ अध्ययनों ने डीपी मेसेनचिम और न्यूरोनल एफ्रेंट्स के बीच क्रॉसटॉक में विस्तृत जानकारी प्रदान की है। ज्ञान में इस अंतर को दूर करने के लिए, शोधकर्ताओं ने इन बातचीत की जांच करने के लिए सह-संस्कृतियों और विभिन्न तकनीकों का उपयोग करना शुरू कर दिया है । यहां, हम टीजी न्यूरॉन्स के साथ प्राथमिक डीपी कोशिकाओं को सह-खेती करने में शामिल कई चरणों को प्रदर्शित करते हैं जो छिद्रों के माध्यम से अक्षीय विकास की अनुमति देने के लिए बड़े व्यास छिद्रों के साथ एक अंतर्निहित ट्रांसवेल फिल्टर पर फैले हुए हैं। लोक्सपी साइटों द्वारा घिरे ब्याज के जीन के साथ प्राथमिक डीपी कोशिकाओं का उपयोग एडेनोवायरस-क्रे-जीएफपी पुनर्संयोजन प्रणाली का उपयोग करके जीन विलोपन को सुविधाजनक बनाने के लिए किया गया था। थाय1-वाईएफपी माउस से टीजी न्यूरॉन्स का उपयोग सटीक afferent इमेजिंग के लिए अनुमति दी, अभिव्यक्ति के साथ अच्छी तरह से confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पृष्ठभूमि के स्तर से ऊपर । डीपी प्रतिक्रियाओं की जांच प्रोटीन या आरएनए संग्रह और विश्लेषण के माध्यम से की जा सकती है, या वैकल्पिक रूप से, हटाने योग्य ग्लास कवरस्लिप पर चढ़ाए गए डीपी कोशिकाओं के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला के माध्यम से। मीडिया को प्रोटेओमिक विश्लेषण जैसी तकनीकों का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है, हालांकि मीडिया में भ्रूण गोजातीय सीरम की उपस्थिति के कारण एल्बुमिन कमी की आवश्यकता होगी। यह प्रोटोकॉल एक सरल विधि प्रदान करता है जिसे सह-संस्कृति परख के नियंत्रित वातावरण के जवाब में टीजी न्यूरॉन्स और डीपी कोशिकाओं की रूपात्मक, आनुवंशिक और साइटोस्केलेटल प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है।

Introduction

दांत अंतरावण दांतों को दबाव, तापमान और सूजन को समझने की अनुमति देता है, जो सभी दांत के अंग के उपयोग और रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण हैं। दंत क्षय और आघात से जुड़े दांतदर्द को समझने में विफलता रोग प्रगति की ओर ले जाती है। इस प्रकार, उचित अंतरावण सामान्य दांत के विकास, कार्य और देखभाल के लिए एक आवश्यकता है।

जबकि अधिकांश अंग जन्म के समय पूरी तरह से कार्यात्मक और आंतरिक होते हैं, दांत का विकास वयस्क जीवन में फैला हुआ है, दांत अंतरावण और खनिजीकरण प्रसवोत्तर चरणों के दौरान संगीत कार्यक्रम में होने वाली1,2। दिलचस्प बात यह है कि दंत लुगदी (डीपी) मेसेनचिम शुरू में भ्रूण उत्पत्ति के दौरान रिपेलेंट संकेतों को स्रावित करता है ताकि विकासशील दांत अंग में एक्सॉन प्रवेश को रोका जा सके, जो बाद में आकर्षित कारकों के स्राव में बदलाव करता है क्योंकि दांत विस्फोट3,4के पास होता है। प्रसवोत्तर चरणों के दौरान, ट्राइजेमिनल (टीजी) तंत्रिका से एफ्रेरेंट एक्सोन उस समय के आसपास दांत में और पूरे दांत में प्रवेश करते हैं ( पेजला, पी एट अल5में समीक्षा की जाती है)। वीवो अध्ययनों में कई ने दिखा दिया है कि चूहों में न्यूरोनल-मेसेनचिमल इंटरैक्शन गाइड दांत अंतरण (लुक्को, के एट अल6में समीक्षा की गई), लेकिन आणविक तंत्र के कुछ विवरण उपलब्ध हैं।

सेल सह संस्कृतियों नियंत्रित वातावरण है जिसमें जांचकर्ताओं न्यूरोनल और मेसेनचिमल आबादी के बीच बातचीत में हेरफेर कर सकते है प्रदान करते हैं । सह संस्कृति प्रयोगों यह संभव संकेत दांत अंतरीय नहोने और विकास मार्गदर्शक रास्तों में गहरी तल्लीन करना बनाते हैं । हालांकि, सह-संस्कृति में कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कई पारंपरिक तरीकों में तकनीकी चुनौतियां मौजूद हैं। उदाहरण के लिए, न्यूराइट आउटग्रोथ के क्रिस्टल वायलेट धुंधला टीजी बंडल फैलाव में शामिल गैर-विशेष रूप से दाग श्वान कोशिकाओं कर सकते हैं, और अपेक्षाकृत छोटी प्रतिक्रियाओं के साथ रंग तीव्रता में चोटियां हो सकती हैं7। माइक्रोफ्लूइडिक कक्ष एक आकर्षक विकल्प प्रदान करते हैं, लेकिन ट्रांसवेल फिल्टर8,9 की तुलना में काफी अधिक महंगे हैं और केवल डीपी स्राव के लिए न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं की जांच की अनुमति देते हैं। इन मुद्दों का समाधान करने के लिए, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो टीजी स्राव के जवाब में टीजी न्यूराइट आउटग्रोथ की सटीक धुंधला और इमेजिंग की अनुमति देता है, ख) डीपी कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन और/या टीजी न्यूरॉन्स विशिष्ट सिग्नलिंग रास्तों की जांच करने के लिए, और सी) टीजी न्यूरॉन्स द्वारा स्रावित कारकों के लिए डीपी सेल प्रतिक्रियाओं की जांच । यह प्रोटोकॉल एक इन विट्रो सह-संस्कृति परख के नियंत्रित वातावरण में दांत अंतरावशन की कई विशेषताओं की सटीक जांच करने की क्षमता प्रदान करता है।

   

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Protocol

चूहों के साथ सभी प्रयोगों को यूएबी इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) ने मंजूरी दी थी ।

1. प्लेट तैयारकरना

नोट: परख के अंत में डीपी कोशिकाओं की छवि के लिए कवरस्लिप का उपयोग किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि नमूना प्रसंस्करण के दौरान संदूषण को रोकने के लिए बाँझ ऊतक संस्कृति हुड के बाहर सभी ऊष्मायन और रिंसिंग चरणों के दौरान प्लेट ढक्कन चालन है।

  1. कवरस्लिप तैयारी
    1. ऑटोक्लेव परिपत्र कवरस्लिप।
    2. हुड के नीचे अल्ट्राप्योर पानी को छान लें।
    3. कवरस्लिप को 24-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें और हर एक को 0.1 मिलीग्राम/एमएल पॉली-डी-लाइन के 400 माइक्रोन के साथ कवर करें।
    4. कवरस्लिप को भिगोने की अनुमति दें, 5 मिन के लिए डूबे हुए, 40-50 आरपीएम पर 12 आरपीएम या ऑर्बिटल शेकर पर एक घुमाव पर। सुनिश्चित करें कि ढक्कन संदूषण को रोकने के लिए चालहै।
    5. 50 आरपीएम पर 12 आरपीएम या शेकर पर रॉकर पर लगभग 5 मिन के लिए फ़िल्टर किए गए अल्ट्राप्योर पानी के साथ कवरस्लिप को कुल्ला करें। दोहराएँ.
    6. वाष्पीकरण की सुविधा के लिए प्लेट ढक्कन बंद के साथ हुड के नीचे कम से कम 2 घंटे के लिए कवरस्लिप को सूखने दें। इन कवरस्लिप का इस्तेमाल 48 एच के अंदर किया जाना चाहिए।
    7. इम्यूनोफ्लोरेसेंस (धारा 3.3) के लिए परख के अंत में कवरस्लिप और प्रक्रिया के ऊपर बीज डीपी कोशिकाएं।
  2. कोटिंग फिल्टर
    1. पतला लेमिनिन से 10 μg/mL । हुड के नीचे पतला लेमिनिन फ़िल्टर करें।
    2. एक 24-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में 10 μg/mL टुकड़े टुकड़े के 450-500 μL ।
    3. ट्रांसवेल फिल्टर, 3 माइक्रोन पोरोसिटी, एक अच्छी तरह से रखें ताकि यह लेमिनिन समाधान से संपर्क करे और इसे 2 घंटे या रात भर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में छोड़ दे। फिल्टर छिद्रों को फिल्टर के ऊपर और नीचे दोनों को फैलाने और कोट करने के लिए कुछ समाधान की अनुमति देनी चाहिए। इन फिल्टरों का उपयोग 48 घंटे के भीतर किया जाना चाहिए या 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में रखा जाना चाहिए।

2. वैकल्पिक आनुवंशिक हेरफेर के साथ सेल चढ़ाना

  1. चूहों: मेसेनचिमल-न्यूरोनल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए डीपी कोशिकाओं का आनुवंशिक परिवर्तन किया जा सकता है (लेकिन आवश्यक नहीं है)। सुझाए गए आनुवंशिक विविधताओं के लिए अनुभाग 2.3 और 2.4 देखें।
  2. डीपी विच्छेदन, फैलाव और चढ़ाना(चित्रा 1)
    नोट: डीपी विच्छेदन के लिए, अल्ट्रा-फाइन, स्ट्रेट-एज संदंश का उपयोग करें। अल्ट्रा-फाइन किनारों उपयोगकर्ता खनिज संरचना और डीपी ऊतक के बीच संदंश किनारे कील करने की अनुमति देगा।
    1. हार्वेस्ट P5-P8 चूहों। इस अवस्था में दांतों को मिनरलाइज करना चाहिए, और जड़ खुली है।
    2. हाइपोथर्मिया के माध्यम से नवजातों को 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में एक डिश में रखकर जब तक वे अब स्थानांतरित या स्पर्श का जवाब नहीं देते हैं। डेपुटेशन द्वारा और नामित सुविधा पर आईएसीयूसी प्रक्रियाओं के अनुसार नवजातों को इच्छामृत्यु दें।
    3. प्रत्येक माउस से डीपी एकत्र करने के लिए 50 मिलीआर शंकुट्यूब में 0.25% ट्राइप्सिन-ईटीए का 3-5 मिलीएल एलिकोट तैयार करें। इससे प्रसवोत्तर चूहों से दंत लुगदी के पाचन में आसानी होगी। यदि 10 से अधिक प्रसवोत्तर चूहों से ऊतक पचाने से 3 मिलीएल से अधिक का उपयोग करें।
    4. सिर को डिस्पोजेबल अंडरपैड पर रखें ताकि मुंह छत की ओर हो और गर्दन का आधार काम की सतह पर सपाट हो। मटिला से मंडीबल को अलग करने के लिए एक आरागति में रेजर ब्लेड का उपयोग करें।
    5. वैकल्पिक रूप से या तो कैंची के साथ या मोलार्स के लिए आसान पहुंच की अनुमति देने के लिए संदंश के साथ जीभ को हटा दें।
    6. एक बाँझ धुंध पैड के ऊपर एक डिश में खोला सिर रखें और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप(चित्रा 1डी)के नीचे नमूना जगह है ।
    7. पहले मोलर्स के आसपास के अल्वेलर हड्डी के ऊतकों को हटा दें। उपमंडीबुल्लर दांत इस बिंदु पर पूरी तरह से उभर नहीं रहे हैं। अल्वेलर खोलने में संदंश डालें और ऊतक को दांत से दूर मुंह के बुक्कल (गाल) या भाषाई (जीभ) की ओर चिढ़ाएं। अधिकतम दांत जोखिम और हटाने के लिए दांत के चारों ओर फांक को पूरी तरह से हटाने की आवश्यकता होगी।
    8. उपमंडीबुलर और मैक्सिलरी पहले मोलर्स (M1s) को 1x फॉस्फेट-बफरलव (पीबीएस) के साथ एक अलग सेल कल्चर डिश में धीरे से स्थानांतरित करें।
    9. 2.2.4-2.2.8 दोहराएं जब तक कि सभी M1s एकत्र न हो जाएं। कटाई के दौरान बर्फ पर M1s युक्त पकवान रखें।
    10. प्रत्येक M1 के बाहर आसपास के तामचीनी बाहरी अंग (ईओई) को हटा दें। यह वैकल्पिक रूप से चरण 2.2.11 के बाद किया जा सकता है।
    11. संदंश का एक सेट के साथ, M1 घुमाएं ताकि मुहाएं नीचे हों और खुली जड़ सामने आ जाए। दांत के नीचे एक अंडाकार उद्घाटन होगा, और अपारदर्शी डीपी ऊतक डेंटिन और तामचीनी की एक पतली परत से समझाया जाएगा।
    12. संदंश की नोक का उपयोग करके, खनिज ऊतककी आंतरिक परिधि के चारों ओर संदंश के एक हाथ को चलाकर डीपी को धीरे से ढीला करें। डीपी ऊतक को खनिज संरचना से बाहर निकालें और इसे 1x पीबीएस युक्त तीसरे पकवान में स्थानांतरित करें। ईओई को हटा दें यदि यह पहले से अलग नहीं था(चित्रा 1ई)।
    13. सभी डीपी ऊतक को 50 मिलील शंकुट्यूब में 0.25% ट्राइप्सिन-ईटीए में स्थानांतरित करें। भंवर मिश्रण और 10 00 00 के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्म पानी स्नान में जगह है। यह एक ही संदंश के साथ या लंबे, शीशी संदंश के साथ किया जा सकता है। ऊतक को तितर-बितर करना मुश्किल होगा और हर 3-4 मिन को भंवर की आवश्यकता होगी। 10 मिन ट्राइप्सिनाइजेशन से अधिक न करें क्योंकि ट्राइप्सिन कोशिका झिल्ली को नुकसान पहुंचा सकता है।
    14. एक बाँझ हुड के तहत, एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए ट्राइप्सिन के लिए कम से कम 1:1 मीडिया के अंतिम अनुपात में गर्म सह-संस्कृति मीडिया(तालिका 1)जोड़ें। यदि अधिक ऊतक फैलाव वांछित है तो बड़े अनुपात स्वीकार्य हैं।
    15. मीडिया में डीपी को और तितर-बितर करने के लिए 10 मीटर पाइपेट के साथ कई बार मीडिया को ऊपर और नीचे पिपेट करें। बड़े बुलबुले से बचने के लिए सावधान रहें। ऊतक की चिपचिपा प्रकृति के कारण पूर्ण फैलाव लगभग असंभव है। हालांकि, यह भी आवश्यक नहीं है क्योंकि कोशिकाएं एक बार चढ़ाया जाने के बाद ऊतक से जावक माइग्रेट करेंगी।
    16. एक 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट(चित्रा 1एफ)के प्रत्येक अच्छी तरह से फैलाया डीपी के 1 mL स्थानांतरण ।
    17. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें और कोशिकाओं को मीडिया बदलने से पहले 48 घंटे के लिए बिना बिखरे ऊतक से संलग्न और माइग्रेट करने की अनुमति दें। प्राथमिक कोशिकाओं को अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता पर चढ़ाया जाना चाहिए ताकि 1 सप्ताह के भीतर 85-90% संगम तक पहुंच सके। यदि यह 1 सप्ताह के बाद प्राप्त नहीं किया जाता है, तो प्लेट को त्याग दें।
  3. डीपी कोशिकाओं के वैकल्पिक आनुवंशिक हेरफेर
    1. सेल सिग्नलिंग रास्तों को बदलने के लिए, जेनेटिक नॉकआउट चूहों से या चूहों से हार्वेस्ट डीपी कोशिकाएं जिसमें लोक्सपी साइटों द्वारा ब्याज का जीन फ्लैंक किया जाता है। बाद के मामले में, जीन को नीचे वर्णित पार्श्व जीन को हटाने के लिए एडेनोवायरस-क्रे-जीएफपी (विज्ञापन-क्रे-जीएफपी) का उपयोग करके हटाया जा सकता है। एडेनोवायरस-ईजीएफपी (विज्ञापन-ईजीएफपी) का उपयोग नियंत्रण वायरस के रूप में करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वायरल संक्रमण से सेलुलर प्रतिक्रिया नहीं होती है।
      नोट: विज्ञापन-ईजीएफपी को सीएमवी प्रमोटर एन्हांसर द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जो बहुत मजबूत है। विज्ञापन-क्रे-जीएफपी को एक आईआरईआईआर द्वारा विनियमित किया जाता है, जो क्रे और जीएफपी के बीच एक आंतरिक नियामक क्षेत्र है, जो बहुत मजबूत नहीं है। इसके परिणामस्वरूप विज्ञापन-क्रे-जीएफपी कोशिकाओं की तुलना में विज्ञापन-ईजीएफपी कोशिकाओं में उज्जवल फ्लोरेसेंस होता है। सेलुलर फ्लोरेसेंस के स्तर पर नहीं, कोशिकाओं की कुल संख्या के आधार पर समकक्ष संक्रमण के स्तर की पुष्टि करें।
    2. वायरस युक्त मीडिया के ५०० μL और 10 μg/mL पॉलीब्रेन प्रति अच्छी तरह से तैयार करें । पॉलीब्रेन संगम10के पास कोशिकाओं में वायरल संक्रमण के साथ सहायता करता है । यह प्रोटोकॉल ईडी-ईजीएफपी के लिए 100 की संक्रमण (एमओआई) की बहुलता और सेल व्यवहार्यता पर कम या कोई प्रभाव नहीं होने के साथ कुशल जीन संक्रमण के लिए 200 विज्ञापन-क्रे-जीएफपी पर आधारित है। अनुमानित सेल संख्या 4 x 104 कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से थाली की है:
      Equation 1
    3. संक्षिप्त भंवर या पाइपिंग के साथ मीडिया मिलाएं और प्रत्येक अच्छी तरह से 500 μL जोड़ें।
    4. 24 घंटे के बाद, सह-संस्कृति मीडिया का एक अतिरिक्त 500 माइक्रोन जोड़ें जिसमें अतिरिक्त पॉलीब्रेन या वायरस शामिल नहीं है।
    5. कुल ४८ एच के बाद, एस्पिरेट वायरस युक्त मीडिया और ताजा सह संस्कृति मीडिया के साथ बदलें । इस बिंदु पर, ट्रांसवेल फिल्टर के ऊपर टीजी न्यूरॉन्स जोड़ा जा सकता है।
  4. ट्राइजेमिनल न्यूरॉन विच्छेदन, फैलाव और चढ़ाना
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, डीपी कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति में न्यूराइट आउटग्रोथ की इमेजिंग किशोर (6 सप्ताह पुरानी) B6.Cg-टीजी का उपयोग करके अनुकूलित की गई थी।Thy1-YFP) 16Jrs/J चूहों । Thy1-YFP चूहों के केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र में एक पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) टैग होता है जिसकी अभिव्यक्ति न्यूरॉन्स में P6-P10 के आसपास शुरू होती है और प्रसवोत्तर और वयस्क जीवन के दौरान तंत्रिका तंत्र में तेजी से बढ़ जाती है11,12. YFP और GFP ने उन दृश्यों को संरक्षित किया है जो इन नसों को एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी से दाग ने की अनुमति देते हैं, जिसके परिणामस्वरूप पैन-न्यूरोनल दाग होता है। अंततः, ये चूहे कोशिका संस्कृति में उपयोग किए जाने वाले और उगाए जाने वाले न्यूरॉन्स के बेहतर दृश्य और मात्राकरण की अनुमति देते हैं।
    1. कार्बन डाइऑक्साइड के साथ किशोर चूहों को इच्छामृत्यु दें जिसके बाद सर्वाइकल अव्यवस्था होती है।
    2. चूहों को काटना और खोपड़ी से त्वचा को हटा दें। पुरुषों और महिलाओं की समकक्ष संख्या को शामिल करना सुनिश्चित करें।
    3. खोपड़ी के आधार में माइक्रो-विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी की नोक डालें। खोपड़ी के सजीटल सीवन के साथ कट(चित्रा 1ए)।
    4. चार छोटे क्षैतिज कटौती करें: कानों द्वारा कोरोनल टांके के साथ दो, और खोपड़ी के आधार पर लैम्ब्डॉइड टांके के साथ दो। इससे हड्डी के दो फ्लैप पैदा होने चाहिए।
    5. हड्डी के दो फ्लैप को छीलने के लिए संदंश का उपयोग करें। इससे दिमाग को पता चल जाना चाहिए।
    6. मस्तिष्क को हटा दें। सिर को 1x पीबीएस के साथ एक ऊतक संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें और माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
    7. टीजी गैंगलिया का पता लगाएं, जो कृंतक13में आसानी से दिखाई देता है, मस्तिष्क और मैक्सिलरी प्रक्रिया की हड्डी(चित्रा 1बी)के बीच ड्यूरा पदार्थ में स्थित है।
    8. आंखों, मैक्सिला और मंडीबल की यात्रा करने वाली तीन शाखाओं को काट लें और सीधे किनारे के ठीक संदंश का उपयोग करके गंगलिया को ठंडे 1x पीबीएस में स्थानांतरित करें। कटाई के दौरान बर्फ पर टीजी गैंगलिया युक्त पकवान रखें।
    9. एक बार सभी टीजी बंडलों की कटाई कर रहे हैं, एक ५० mL शंकुधारी ट्यूब के लिए एक 5 मिलीग्राम/mL बाँझ-फ़िल्टर कोलेजेनेज़ प्रकार द्वितीय शीशी संदंश का उपयोग कर के स्थान पर ।
    10. भंवर टीजी बंडल के साथ कोलेजेनेस और ट्यूब को 25-30 0 0 0 0 00 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में रखें। इस दौरान शंखनाद को पानी के स्नान, भंवर से बाहर निकालकर हर 5-10 की नोंक पर स्नान करके लौट ें।
    11. 643 x ग्रामपर 2 मिन के लिए कोलेजेनेज़-टीजी न्यूरॉन समाधान को सेंट्रलाइज कर दें।
    12. एक ऊतक संस्कृति हुड के तहत, धीरे-धीरे माइक्रोपाइपेट के साथ कोलेजेनेज़ को एस्पिरेट करें।
    13. 1% बाँझ-फ़िल्टर तिपसिन प्रकार द्वितीय और भंवर के 5 mL जोड़ें। शंकुई ट्यूब को 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
    14. 643 x ग्रामपर 5 मिन के लिए ट्राइप्सिन-टीजी मिश्रण को सेंट्रलाइज करें। ट्राइप्सिन के ऊपर ी हिस्से को माइक्रोपिपेट से निकालें, ताकि टीजी न्यूरॉन्स न निकल जाएं। अभी भी ट्यूब में तरल होगा।
    15. शेष ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए पर्याप्त मीडिया जोड़ें (मीडिया में ट्रिप्सिन के 1:1 या कम अनुपात पर)।
    16. कोशिकाओं की संख्या गिनें और समाधान को 200,000 कोशिकाओं/mL (सेल युक्त 50,000 कोशिकाओं के 250 माइक्रोन) को पतला करें।
    17. डीपी के साथ कुओं में धारा 1.2 से लेपित ट्रांसवेल फिल्टर रखें।
    18. कोशिका युक्त समाधान को पतला करें ताकि 200,000 कोशिकाएं/एमएल हो। ट्रांसवेल फिल्टर पर 250 माइक्रोन, और संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस रात में कोशिकाओं(चित्रा 1एफ)।
    19. अगले दिन, मीडिया को 1 माइक्रोन यूरीडीन और 15 माइक्रोएम 5'-फ्लोर-2'डिऑक्सीरिडीन के साथ सह-संस्कृति मीडिया के 1 मिलील के साथ प्रतिस्थापित करें ताकि मेसेनचिमल कोशिकाओं के अधिक प्रसार को रोका जा सके जो न्यूराइट आउटग्रोथ को रोक सकता है। वैकल्पिक: आगे हेरफेर का प्रयास करते हुए इस मीडिया में विकास कारक ों या अवरोधकों को जोड़ें।
    20. अतिरिक्त वांछित समय अंक के लिए कोशिकाओं को संस्कृति। इस प्रोटोकॉल को संस्कृति के 5 कुल दिनों के लिए अनुकूलित किया गया था, जिसमें मीडिया केवल 2 दिन में बदल गया था ताकि माइटोटिक अवरोधकों को जोड़ा जा सके। लंबे समय की अवधि के लिए अतिरिक्त मीडिया परिवर्तन की आवश्यकता होगी ।

3. नमूना संग्रह और प्रसंस्करण

  1. त्रिरत्नीय धुंधला
    1. प्रत्येक ट्रांसवेल फिल्टर को संसाधित करने के लिए ऊतक संस्कृति हुड के तहत 24-अच्छी तरह की प्लेट में बाँझ 1x पीबीएस के पिपेट 1 एमएल एलिकोट्स।
    2. फ़िल्टर के ऊपर तरल को 200-1,000 माइक्रोन पिपेट के साथ हटा दिया जाए, सेल परतों को बरकरार रखने के लिए सावधान रहें। संलग्न कोशिकाओं को संलग्न रहना चाहिए और असंबद्ध कोशिकाएं इस कोमल पाइपिंग के दौरान ढीली आ जाएंगी। एक वैक्यूम फ़िल्टर सेल परत को नुकसान पहुंचा सकता है और आकांक्षा के लिए अनुशंसित नहीं है।
    3. फिल्टर को 1x पीबीएस प्लेट में स्थानांतरित करें, जैसा कि पिछले चरण में उल्लेख किया गया है, मीडिया की शीर्ष परत को हटाना सुनिश्चित करें।
    4. 10 मीटर के लिए एक कक्षीय शेखर पर 12 आरपीएम या 40-50 आरपीएम पर एक घुमाव पर सभी ट्रांसवेल फिल्टर और ढक्कन के साथ थाली रखें ।
    5. ऊपर वर्णित शीर्ष परत सहित पीबीएस को एस्पिरेट करें, 1xPBS के 500 माइक्रोन जोड़ें और एक अतिरिक्त 5-10 मिन कुल्ला के लिए रॉकर या कक्षीय शेखर पर रखें।
    6. 1x पीबीएस को एक बार फिर एस्पिरेट करें और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) से बदलें। कम से कम 500 माइक्रोन का प्रयोग करें ताकि पूरी फिल्टर सतह जलमग्न हो जाए। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 40-50 आरपीएम पर 12 आरपीएम या कक्षीय शेखर पर एक झूली कुरसी पर थाली रखें ।
    7. पीएफए निकालें और 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ एक घुमाव पर प्रत्येक 5-10 मिन के लिए प्लेटों को दो बार कुल्ला।
    8. 10% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) + 5% बकरी/गधा सीरम के साथ ब्लॉक करें, जो द्वितीयक एंटीबॉडी होस्ट जानवर के आधार पर, 0.05% ट्वीन-1xPBS (PBST) में है। समाधान के 450-500 μL का उपयोग करें ताकि फिल्टर तरल में डूब गया है।
      नोट: इस स्तर पर, इन प्लेटों को बाद के समय में प्रक्रिया करने के लिए कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। वाष्पीकरण न हो और वाष्पीकरण के लिए नियमित रूप से जांच करने के लिए प्लेट को सील करने के लिए पैराफिल्म का उपयोग करें ताकि फिल्टर सतहें जलमग्न रहें।
    9. ब्लॉक निकालें और एक अतिरिक्त कुल्ला के बिना 1% बीएसए-PBST में प्राथमिक एंटीबॉडी के 450-500 μL जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, धीरे-धीरे कमाल।
    10. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और कमरे के तापमान पर 3 बार, एक झूली कुरसी पर 1xPBST के 500 μL के साथ कुल्ला
    11. PBST निकालें, प्रकाश क्षरण से फ्लोरोफोरस की रक्षा के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक घुमाव पर माध्यमिक एंटीबॉडी और इनक्यूबेट जोड़ें। फिर से कुल्ला, 3 बार, कमरे के तापमान पर एक झूली कुरसी पर 1x PBST के साथ । 1x पीबीएस के साथ बदलें।
      नोट: इस बिंदु पर, प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है यदि फ्लोरोफोर क्षरण को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा जाता है। वाष्पीकरण न हो और वाष्पीकरण के लिए नियमित रूप से जांच करने के लिए प्लेट को सील करने के लिए पैराफिल्म का उपयोग करें ताकि फिल्टर सतहें जलमग्न रहें। यह एक महीने के भीतर छवि के लिए सबसे अच्छा है।
    12. इष्टतम इमेजिंग के लिए, पृष्ठभूमि के स्तर से ऊपर न्यूरोनल एफ्रेंट्स को विशेष रूप से दागने के लिए एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के साथ Thy1-YFP माउस न्यूरॉन्स का उपयोग करें। यदि थाय1-वाईएफपी चूहे उपलब्ध नहीं हैं तो एक्सोनल संरचनाओं को ठीक दाग देने के लिए एंटी-न्यूरोफिलामेंट 200 का उपयोग करें।
    13. इच्छानुसार छवि। फ़िल्टर को चढ़ाया जाना चाहिए और इसके बजाय एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग के लिए कवरस्लिप या स्लाइड के ऊपर रखा जा सकता है।
      नोट: फ़िल्टर के क्षेत्रों में संबद्ध संरचनाएं नहीं होंगी। एक जेड-स्टैक गहराई के साथ कई छवियों को लें जो सभी संबद्ध संरचनाओं को कैप्चर करता है। बड़े क्षेत्रों में न्यूराइट आउटग्रोथ की कल्पना करने के लिए सिलाई सॉफ्टवेयर का उपयोग करें, या (अधिमानतः) पूरे फिल्टर क्षेत्र।
  2. आरएनए, प्रोटीन, और मीडिया संग्रह
    1. जबकि ट्रांसवेल फिल्टर प्रसंस्करण कर रहे हैं, RNAse/DNAse मुक्त ट्यूबों में मीडिया इकट्ठा और बाद में परख के लिए फ्रीज (एलिसा, प्रोटेओमिक्स, आदि) ।
    2. मीडिया संग्रह के तुरंत बाद, एलिकोफ लाइसिस बफर या रेडियो इम्यूनो वर्षा परख (रिपा) बफर प्रोटीन और फॉस्फेटेज अवरोधकों के साथ कुओं में। इस प्रोटोकॉल को 24-अच्छी प्लेट में 100 माइक्रोन/वेल के लिए अनुकूलित किया गया था।
    3. बफ़र्स को 5 मिन के लिए कोशिकाओं को ले जाने की अनुमति दें, फिर प्रत्येक फ़िल्टर को एक नए पिपेट टिप के साथ परिमार्जन करें, और RNAse/DNAse-मुक्त ट्यूबों में सेल के नमूने एकत्र करें। भविष्य के परखों (अर्ध-मात्रात्मक और/या मात्रात्मक पीसीआर, पश्चिमी दाग, आदि) के लिए लाइसेस फ्रीज करें।
  3. दंत लुगदी कोशिकाओं की वैकल्पिक प्रतिरक्षण:
    1. धीरे-धीरे संदंश के साथ धारा 1.1 से कवरस्लिप उठाएं और उन्हें कमाल के साथ 1 घंटे के लिए 4% पीएफए के साथ अलग-अलग कुओं में स्थानांतरित करें।
    2. एस्पिरेट पीएफए और 1x पीबीएस के साथ दो बार कवरस्लिप कुल्ला । मानक प्रतिरक्षण तकनीकों के साथ ब्याज के मार्कर के लिए परमीबिलाइजेशन, अवरुद्ध और प्रतिरक्षण के साथ इसका पालन करें।

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Representative Results

इन परिणामों से पता चलता है कि टीजी न्यूराइट मोनोकल्चर(चित्रा 2ए, सी)के नियंत्रण की तुलना में अंतर्निहित अच्छी तरह से प्राथमिक डीपी कोशिकाओं की उपस्थिति में टीजी न्यूराइट आउटग्रोथ में वृद्धि हुई थी। न्यूराइट आउटग्रोथ में कुछ परख-से-परख परिवर्तनशीलता है । इस प्रकार, एक टीजी न्यूरॉन मोनोकल्चर को न्यूराइट आउटग्रोथ के बेसल स्तर का पता लगाने के लिए नियंत्रण के रूप में सभी कोसों में शामिल किया जाना चाहिए। विज्ञापन-क्रे-जीएफपी और विज्ञापन-ईजीएफपी के संक्रमण के बाद इस प्रोटोकॉल में टीजीबीआर2एफ/एफ माउस से प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग कोशिकाओं के समकक्ष संख्या में पुष्टि की गई(चित्रा 2डी)किया गया था । विज्ञापन ईजीएफपी ने कंट्रोल वायरल वेक्टर के तौर पर काम किया। विज्ञापन-क्रे-जीएफपी ने अर्ध-मात्रात्मक पीसीआर(चित्रा 2ई)द्वारा प्रदर्शित फ्लैंक जीन, Tgfbr2 को हटा दिया। विकास कारक बीटा रिसेप्टर 2 (Tgfbr2) हटाने के साथ संस्कृतियों में, न्यूराइट आउटग्रोथ में कमी आई(चित्रा 2ए-सी)।

हमने थाय1-वाईएफपी माउस टीजी न्यूरॉन्स का उपयोग किया और उन्हें एक एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के साथ दाग दिया जो इस पृष्ठभूमि के ऊपर अच्छी तरह से एक्सोनल संरचनाओं की बहुत विशिष्ट और उज्ज्वल छवियों का उत्पादन करता है, जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है। इसने क्रिस्टल वायलेट7जैसे पहले सूचित तरीकों का उपयोग करके गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं के गैर-विशिष्ट धुंधला के बिना न्यूरोनल मार्कर के विशिष्ट धुंधला होने की अनुमति दी। फिल्टर में बड़े छिद्रों ऑटोफ्लोरेस और/या माध्यमिक एंटीबॉडी जमा कर सकते हैं और एक्सोनल इमेजिंग(चित्रा 3)की परिशुद्धता को कम कर सकते हैं । जबकि इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ Thy1-YFP न्यूरॉन्स इमेजिंग में काफी सुधार करता है, आगे की पृष्ठभूमि को ऑटो-थ्रेसिंग सॉफ्टवेयर के साथ हटाया जा सकता है और फिर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। हम हमारे प्रारंभिक निष्कर्षों (दिखाए नहीं) के साथ-साथअन्य 8,9 यदि थाय1-वाईएफपी चूहे उपलब्ध नहीं हैं, तो न्यूरोफिलामेंट 200 के लिए प्रतिरक्षण करने की भी सलाह देते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: सह संस्कृति के लिए कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए माउस विच्छेदन की एक योजनाबद्ध । (क)माउस खोपड़ी को खोलने और टीजी नसों का पता लगाने के लिए जहां काटना है, का एक आरेख, अंतिम चित्रण में काले रंग में दिखाया गया है। कैंची इंगित करता है कि बिंदीदार लाइनों के साथ कटौती करने के लिए कैंची युक्तियां कहां डालें। (ख)एक संयुक्त डार्कफील्ड और जीएफपी छवि जिसमें थाय1-वाईएफपी + टीजी नसों को सफेद रंग में परिक्रमा की गई है । (ग)विच्छेदित टीजी गंगलिया को तब फैलाया और सुसंस्कृत किया जा सकता है, जैसा कि एफमें दिखाया गया है । (D)एक P7 माउस का मंडीबल, बाईं ओर मंडीबल रखने वाले संदंश और जीभ के प्रत्येक तरफ अविस्फोटित दांतों वाले अल्वेलर हड्डी लकीरें के साथ। (ई)डीपी ऊतक (परिक्रमा) खनिज संरचना (ऊपर) से निकाले गए, और तामचीनी बाहरी एपिथेलियम (नीचे) जिसे ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेट में तितर-बितर और प्लेट के लिए हटा दिया गया था, जैसा कि एफमें दिखाया गया है। छवियों को पैमाने पर नहीं दिखाया गया है। डीपी कोशिकाओं को तितर-बितर किया गया और टीजी न्यूरॉन्स जोड़ने से पहले संगम के लिए हो गए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सह संस्कृति से प्रतिनिधि परिणाम । (ए-सी) Thy1-YFP टीजी न्यूरॉन्स प्राथमिक Tgfbr2एफ/एफ डीपी कोशिकाओं के ऊपर 3 μm छिद्रों के साथ ट्रांसवेल फिल्टर में सुसंस्कृत थे । पूरे फिल्टर पर न्यूरोनल संरचनाओं के अत्यधिक विशिष्ट धुंधला प्रदान करने के लिए एक एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी का उपयोग करके वाईएफपी प्रोटीन के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला प्रदर्शन किया गया था। 10x पर 100 माइक्रोएम जेड-स्टैक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों के अधिकतम अनुमानों को एकत्र किया गया और सिलाई सॉफ्टवेयर के साथ सिले गए। टीजी न्यूरॉन्स ने डीपी कोशिकाओं(ए)के साथ सह-संस्कारी होने पर अकेले(सी)की तुलना में काफी अधिक वृद्धि का प्रदर्शन किया। जब न्यूरॉन्स को टीजीबीआर2 (बी)को नीचे गिराने के लिए विज्ञापन-क्रे-जीएफपी से संक्रमित डीपी कोशिकाओं के साथ सह-संस्कारी किया गया तो न्यूट्रिशन आउटग्रोथ प्रेरित नहीं हुई । स्केल बार = 1,000 माइक्रोन। विज्ञापन-ईजीएफपी और विज्ञापन-क्रे-जीएफपी से संक्रमित कोशिकाओं की समतुल्य संख्या(डी)में दिखाई जाती है। स्केल बार = 125 माइक्रोन। अर्ध-मात्रात्मक पीसीआर ने Tgfbr2 केडी(ई)की पुष्टि की । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: तकनीकी कठिनाइयों afferent इमेजिंग में प्रस्तुत किया । (A)सेल आबादी के क्रिस्टल वायलेट धुंधला के बाद ट्रांसवेल फिल्टर की ब्राइटफील्ड इमेजिंग। बड़े छिद्र प्रचलित हैं। बड़ा तीर एक कोशिका बताता है जो मेसेनचिमल आकृति विज्ञान को प्रदर्शित करता है, जबकि छोटा तीर न्यूरोनल आकृति विज्ञान की कोशिका को इंगित करता है। क्रिस्टल वायलेट पूर्वाग्रह के बिना दोनों कोशिकाओं दाग । (ख)एलेक्सा-488 द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ 3 ट्यूबलिन के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला ने कई कोशिकाओं के गैर-विशिष्ट धुंधला दिखाया, जिससे असंबद्ध संरचनाओं की इमेजिंग मुश्किल हो गई। छवियां प्रतिनिधि हैं और चित्र ा 2में दिखाई गई इमेजिंग को अनुकूलित करने के लिए कई परखों पर दोहराया गया। स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

घटक आयतन एकाग्रता
एमईएम α 440 करोड़
हीट निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरूम 50 करोड़ 10%
100x एल-ग्लूटामाइन 5 लाख 1x
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 x 5 लाख 1x
इन अंतिम सांद्रता पर माइटोटिक अवरोधकों के साथ 2 दिन पर मीडिया बदलें
यूरीडीन 1 माइक्रोन
5'-फ्लोर-2'deoxyuridine 15 माइक्रोन

तालिका 1: सह संस्कृति मीडिया ।

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Discussion

मौखिक गुहा की दैनिक गतिविधियों के लिए उचित उपयोग और रखरखाव की अनुमति देने के लिए दांतबाहरी उत्तेजनाओं और आंतरिक सूजन को समझने की आवश्यकता होती है। हालांकि, दांत अंतरावशन की विकास प्रक्रियाओं को चलाने वाले संकेतों के बारे में केवल सीमित जानकारी उपलब्ध है। यह प्रोटोकॉल दो आबादी के बीच क्रॉस-कम्युनिकेशन का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक डीपी कोशिकाओं और टीजी न्यूरॉन्स को अलग और सह-संस्कृति करने की विधि प्रदान करता है। कई चर अनुकूलित किया गया और अनुसंधान के खुले आगे रास्ते छोड़, के रूप में नीचे वर्णित है ।

नियंत्रण इस परख में हर कदम पर महत्वपूर्ण हैं । अंतर्निहित डीपी कोशिकाओं के बिना टीजी न्यूरॉन्स के साथ एक ट्रांसवेल फिल्टर टीजी विकास के लिए एक आधार रेखा प्रदान करने के लिए हर परख में शामिल किया जाना चाहिए । विज्ञापन-क्रे-जीएफपी रिकॉम्बिनेज़ के साथ ब्याज के एक पार्श्व जीन को हटाते समय, केवल फ्लोरोसेंट मार्कर को व्यक्त करने वाले नियंत्रण वायरस का उपयोग इस बात की पुष्टि करने के लिए किया जाना चाहिए कि कोशिकाओं की समकक्ष संख्या संक्रमित हो गई है। जबकि हमने क्रमशः विज्ञापन-ईजीएफपी और विज्ञापन-क्रे-जीएफपी के लिए 100 और 200 एमओआई में न्यूनतम कोशिका मृत्यु के साथ संक्रमण के उच्च स्तर का प्रदर्शन किया, प्रत्येक प्रयोगशाला को इस चरण का अनुकूलन करना चाहिए। क्योंकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन विभिन्न प्रमोटरों से जुड़ा हो सकता है और इसलिए संक्रमित की अंतर अभिव्यक्ति समकक्ष संख्या का कारण बनता है, फ्लोरोस्किंग कोशिकाओं की गणना की जानी चाहिए। फ्लोरेसेंस की समग्र तीव्रता अप्रासंगिक है क्योंकि यह संक्रमण की स्थिति को सही ढंग से प्रतिबिंबित नहीं करती है। जीन को हटाने का प्रदर्शन करना महत्वपूर्ण है, जैसा कि इस प्रोटोकॉल(चित्रा 2)में अर्ध-मात्रात्मक पीसीआर के साथ दिखाया गया है। हालांकि इस प्रोटोकॉल ने इस विषय का समाधान नहीं किया, पिछले शोध ने दिखादिया कि अन्य कोशिकाओं लाइनों के साथ नियंत्रण परखों को यह प्रदर्शित करने के लिए शामिल किया जा सकता है कि न्यूराइट आउटग्रोथ विशेष रूप से डीपी कोशिकाओं8के साथ सह-संस्कृति द्वारा प्रेरित है।

क्योंकि यह प्रोटोकॉल प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग करता है, कई चरण हैं जिन पर संदूषण शुरू किया जा सकता है। इसे रोकने के लिए, सभी अभिकर्मकों को बाँझ फ़िल्टर किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, यह सिफारिश की जाती है कि परख की पूरी विफलता के बिना एक फिल्टर और दूषित कुएं की नसबंदी को हटाने के लिए अनुमति देने के लिए डुप्लिकेट या ट्रिपलकेट में हर चर के लिए प्रयोग चलाए जाएं।

कवरस्लिप को डीपी सेल आसंजन सुनिश्चित करने के लिए पॉली-डी-लाइसिन और/या एक एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ लेपित किया जाना चाहिए । जबकि कोशिकाओं को शुरू में देते हैं, वायरल संक्रमण अनकोटेड कवरस्लिप पर सेल उठाने मौत का कारण बनता है और सह संस्कृति परख के आनुवंशिक हेरफेर को रोकता है ।

यह अच्छी तरह से स्थापित है कि टीजी गंगलिया से श्वान कोशिकाओं जैसे गैर-न्यूरोनल कोशिकाएंसंस्कृति 14,15,16में न्यूरोनल कोशिकाओं के अस्तित्व को प्रभावित कर सकती हैं। इस प्रोटोकॉल में, न्यूरोनल सर्वाइवल को 1 माइक्रोन यूरीडीन और 15 माइक्रोन 5-फ्लोरो-2'डिऑक्सीयूरिन जोड़कर अनुकूलित किया गया था। श्वार्न सेल प्रसार को बाधित करने के लिए इन एंटीमिटोटिक एजेंटों के अलावा, न्यूराइट आउटग्रोथ नहीं होगी। यह अज्ञात है कि क्या सह-संस्कृति में इन सेंसेंट श्वान कोशिकाओं की उपस्थिति न्यूरोनल प्रतिक्रिया को बदल देती है। अलग-थलग करने वाले मूत्र न्यूरॉन्स के लिए कई अतिरिक्त चरणों की आवश्यकता होती है, और जांचकर्ताओं के लिए प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं जो इस चर17को हटाना चाहते हैं। या तो मामले में, न्यूरॉन फैलाव कुछ हद तक एक axotomy नकल करता है और चोट का प्रतिनिधित्व करने के लिए विचार किया जा सकता है/ विट्रो में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स से निकलना विकास बनाम fascicles से वीवो एक्सोनल विकास में अंतर निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता होगी, और इन प्रोटोकॉल में संबोधित नहीं कर रहे हैं ।

इस प्रोटोकॉल को शुरू से खत्म करने के लिए 1-3 सप्ताह लगते हैं । हालांकि डीपी कोशिकाओं का उपयोग करना संभव है जिन्हें 85-90% संगम तक पहुंचने के लिए 1 सप्ताह से अधिक की आवश्यकता होती है, यह सिफारिश की जाती है कि कोशिकाओं को कुछ दिनों के भीतर संगम तक पहुंचने के लिए उच्च पर्याप्त घनत्व पर वरीयता दी जाए क्योंकि ये कोशिकाएं उस बिंदु को बहुत धीरे-धीरे विभाजित करती हैं। यह आम तौर पर एक 24 अच्छी तरह से थाली की पंक्ति प्रति 5-7 P5-8 चूहों के आसपास की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल को कुल 5 दिनों की सह-संस्कृति के लिए अनुकूलित किया गया था, जिस पर फेनोल रेड के साथ मीडिया ने रंग को स्थानांतरित करना शुरू कर दिया। अगर अब परख की इच्छा हो तो मीडिया को बदला जाना चाहिए।

डीपी स्रावित कारकों द्वारा मानक ईसीएम-लेपित ऊतक संस्कृति प्लेटों3,19,20,21 या माइक्रोफ्लूइडिककक्ष8,22, 23के साथ गुप्त कारकों के जवाब में न्यूराइट आउटग्रोथ प्रदर्शित करने के लिए कई सह-संस्कृति परखों का प्रदर्शन किया गया है । यह प्रोटोकॉल इन तरीकों पर कई फायदे प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, टीजी गंगलिया और डीपी ऊतक सह-संस्कृति को कम दूरी के पैराक्रिन संकेतों को समझने और प्रतिक्रिया देने के लिए न्यूराइट्स के लिए एक विशिष्ट स्थानिक संबंध की आवश्यकता होती है। अंग संस्कृति के साथ, केवल डीपी ऊतक के निकटतम गंगलिया में न्यूट्रिशन3का जवाब देने में सक्षम हैं, जबकि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बिखरे हुए टीजी न्यूरॉन्स नीचे डीपी कोशिकाओं से बराबर दूरी पर सुसंस्कृत हैं। दूसरा, अंग संस्कृतियों बड़े नमूनों में उपलब्ध ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की कमी के कारण ऊतक परिगलन शुरू कर सकते हैं24। तितर-बितर कोशिकाओं की सह-संस्कृति इस संभावना को दूर करती है। न्यूरॉन्स सहित कुछ सह संस्कृतियों न्यूरोनल मीडिया3,22 जो न्यूराइट आउटग्रोथ को बढ़ावा देने में एक प्रमुख भूमिका निभा सकते है की आवश्यकता है । यह प्रोटोकॉल न्यूरॉन-विशिष्ट विकास कारकों को नहीं जोड़ता है, जिससे अंतर्निहित डीपी कोशिकाओं और न्यूराइट आउटग्रोथ प्रतिक्रियाओं से पैराक्रिन संकेतों के बीच सीधे संबंध के मूल्यांकन की अनुमति मिलती है। यह उल्लेखनीय है कि सह-संस्कृति मीडिया में भी खनिजीकरण को बढ़ावा देने के लिए घटकों का अभाव है, जैसे बीटा-ग्लाइसेरोफॉस्फेट । यह जांचकर्ताओं को यह निर्धारित करने की अनुमति देता है कि खनिजीकरण को प्रोत्साहित करने के लिए न्यूराइट्स संकेतों को कैसे स्रावित कर सकते हैं। हालांकि, यह भी खनिज odontoblasts कि आम तौर पर वीवो में मौजूद होगा बिना केवल कम विभेदित डीपी कोशिकाओं सहित द्वारा अध्ययन सीमा ।

पिछले शोध7,8 से कोलोरेमेट्रिक प्रतिक्रियाएं श्वान सेल योगदान को रेखांकित नहीं करती हैं और न ही क्रिस्टल वायलेट गैर-विशेष रूप से सभी कोशिकाओं को दाग देने के बाद से न्यूरोनल आकृति विज्ञान प्रदर्शित करती हैं। फिल्टर के इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला उच्च पृष्ठभूमि के स्तर में परिणाम कर सकते है कि afferent इमेजिंग मुश्किल(चित्रा 2)। वर्तमान प्रोटोकॉल Thy1-YFP टीजी न्यूरॉन्स और एक एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी का उपयोग करके न्यूरोनल एफ्रेरेंट के सटीक धुंधला होने की अनुमति देता है और एक पूरे आंकड़े(चित्रा 3)में विकास की बड़ी छवियों को उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त उज्ज्वल संकेत प्रदान करता है। यदि थाय1-वाईएफपी चूहे उपलब्ध नहीं हैं, तो एंटी-न्यूरोफिलामेंट 200 जैसे अन्य न्यूरोनल मार्कर का उपयोग करना संभव है।

अंत में, लोक्सपी साइटों द्वारा घिरा ब्याज के जीन के साथ चूहों से प्राथमिक डीपी कोशिकाओं का उपयोग करना विज्ञापन-क्रे-जीएफपी प्रणाली के साथ इन जीनों को सरल और कुशल हटाने की अनुमति देता है। भविष्य के अध्ययनों में, विज्ञापन-क्रे recombinase प्रणाली टीजी न्यूरॉन्स पर इस्तेमाल किया जा सकता है अगर वे loxP साइटों द्वारा flanked ब्याज का एक जीन है । यह इस अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगा कि न्यूरोनल आबादी से पैराक्रिन संकेत डीपी कोशिकाओं को कैसे प्रभावित करते हैं, खासकर यदि डीपी कोशिकाओं को कवरस्लिप (धारा 1.1) के ऊपर वरीयता प्राप्त किया जाता है। भविष्य के अध्ययन अन्य जोड़तोड़ का उपयोग कर सकते हैं, जैसे औषधीय अवरोधकों और/या विकास कारकों के अलावा । 8 माइक्रोन पोरोसिटी ट्रांसवेल फिल्टर का उपयोग करके माइग्रेशन अध्ययन को शामिल करने के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित करना भी संभव है।

निष्कर्ष में, न्यूरॉन्स और डीपी कोशिकाओं का उपयोग करने वाली यह ट्रांसवेल सह-संस्कृति परख कई सेलुलर मापदंडों की जांच के लिए अनुमति देता है। इससे मेसेनचिमल-न्यूरोनल इंटरैक्शन के बारे में ज्ञान के शरीर को व्यापक बनाना संभव हो जाता है जो दांत अंतरावण को बढ़ावा देते हैं और समर्थन करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड क्रैनियोफेशियल रिसर्च/नेशनल इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ, बी) बर्मिंघम डेंटल एकेडमिक रिसर्च ट्रेनिंग (डार्ट) ग्रांट (नंबर T90DE022736 (PI MacDougall)) में अलबामा विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था। ग) क्रैनियोफेशियल, ओरल एंड डेंटल डिसऑर्डर्स (जीसी-कोडेड) पायलट और एसबीपी और डी को व्यवहार्यता अनुदान के लिए एक यूएबी ग्लोबल सेंटर) नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड क्रैनिओफेशियल एसबीपी को शोध/राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान K99 DE024406 अनुदान।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-Fluoro-2'-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503 Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2
24 Well Cell Culture Plate Corning 3524 Co-culture plate
Alexa-546 anti-chicken Invitrogen A-11040 Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution
Anti-GFP Antibody Aves Lab, Inc GFP-1010 Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution
Anti-Neurofilament 200 antibody Sigma-Aldrich NO142 Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available
B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J The Jackson Laboratory 12603 Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol
B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J The Jackson Laboratory 3709 Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons
Collagenase Type II Millipore 234155-100MG Used to disperse trigeminal neurons
Fetal Bovine Serum Gibco 10437 Additive to co-culture media
Fine forceps Fine Science Tools 11413-11 Fine forceps for TG dissection
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml
Lysis Buffer (Buffer RLT) Qiagen 79216 Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture
L-Glutamine Gibco 25030081 Additive to co-culture media
Micro-dissecting scissors Sigma-Aldrich S3146-1EA Dissection scissors to open skull
Microscope Cover Glass Fisherbrand 12-545-81 Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing
Minimal Essential Medium a Gibco 12571063 Co-culture media base
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070063 Antibiotic additive to co-culture media
Phosphatase Inhibitor Sigma-Aldrich 04 906 837 001 Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture
Polybrene Millipore TR-1003-G Used to aid in dental pulp cell transfection
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P7280 Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion
Protease Inhibitors Millipore 05 892 791 001 Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture
RNAse/DNAse free eppendorf tubes Denville C-2172 Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay
ThinCert Cell Culture Insert Greiner Bio-One 662631 Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 Used fto disperse dental pulp cells
Trypsin Type II Sigma-Aldrich T-7409 Used to disperse trigeminal neurons
Ultra Fine Forceps Fine Science Tools 11370-40 Ultra fine forceps for dissection
Uridine Sigma-Aldrich U3750 Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2
Vacuum Filtration System Millipore SCNY00060 Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter
Vial forceps Fine Science Tools 110006-15 Long forceps for tissue transfer to conicals

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References

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Barkley, C., Serra, R., Peters, S.… More

Barkley, C., Serra, R., Peters, S. B. A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals. J. Vis. Exp. (156), e60809, doi:10.3791/60809 (2020).

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