Brug af en ekstracellulær flux analysator til at måle ændringer i Glycolyse og oxidativ fosforylering under mus Sædcapacitation
Summary
Vi beskriver anvendelsen af en ekstracellulær flux analysator til at overvåge real-time ændringer i glycolyse og oxidativ fosforylering under mus sperm capacitation.
Abstract
Mammalian sperm erhverve befrugtning kapacitet i den kvindelige reproduktive tarmkanalen i en proces, kendt som capacitation. Capacitation-relaterede processer kræver energi. Der er fortsat en løbende debat om de kilder, der genererer ATP, som brændstoffer sperm progressiv motilitet, capacitation, hyperaktivering, og acrosome reaktion. Her beskriver vi anvendelsen af en ekstracellulær flux analysator som et værktøj til at analysere ændringer i energimetabolisme under mus sperm capacitation. Ved hjælp af H+-og O2-følsomme fluorophorer, denne metode gør det muligt at overvåge glycolyse og oxidativ fosforylering i realtid i ikke-kondenseret versus kapaciterende sædceller. Ved hjælp af denne analyse i tilstedeværelse af forskellige energi substrater og/eller farmakologiske aktivatorer og/eller hæmmere kan give vigtig indsigt i bidraget fra forskellige metaboliske veje og skæringspunktet mellem signalering kaskader og metabolisme under sperm capacitation.
Introduction
Anvendelsen af massespektrometri har revolutioneret studiet af metabolisme. Målrettet metabolisk profilering og metabolomic Tracing muliggør præcis overvågning af ændringer i energimetabolisme. Men at udføre metabolomics med succes kræver omfattende uddannelse, erfarne medarbejdere, og dyre, meget følsomme massespektrometre ikke let tilgængelige for alle laboratorier. I de seneste år, ved hjælp af en ekstracellulær flux analysator, såsom Seahorse XFe96 er vokset populære som en surrogat metode til måling af ændringer i energimetabolisme i forskellige celletyper1,2,3,4,5.
Sperm er højt specialiserede motile sædceller celler; hvis opgave er at levere det faderlige genom til oocyte. Sperm forlader den mandlige reproduktive tarmkanalen efter ejakulation er stadig funktionelt umodne og kan ikke befrugte oocyt fordi de ikke er i stand til at trænge ind oocytterne ‘ vestments. Sperm erhverve befrugtning kompetence, som de passerer gennem den kvindelige reproduktive tarmkanalen i en modningsproces kendt som kursuskapacitering6,7. Nyejakuleret sperm eller sperm, der dissekeres fra cauda epididymis, kan kondenseret in vitro ved inkubation i definerede kursuskapacitering-medier indeholdende ca2 +, bicarbonat (HCO3–) eller en celle gennemtrængelig lejr analog (f. eks. dibutyryl-Camp), en kolesterol acceptor (f. eks. bovin serumalbumin, BSA) og en energikilde (f. eks. glucose). Under capacitation, sædceller ændre deres motilitet mønster i en asymmetrisk flagellar beat, der repræsenterer en svømning tilstand kaldet resulterende8,9, og de bliver kompetente til at gennemgå den acrosome reaktion7, hvor Proteolytiske enzymer frigives, at fordøje oocytter ‘ vestments. Disse processer kræver energi, og ligner somatiske celler, sperm generere ATP og andre høje energiforbindelser via glycolyse samt mitokondrie TCA cyklus og oxidativ fosforylering (oxphos)10. Mens flere undersøgelser viser, at glycolyse er nødvendig og tilstrækkelig til at understøtte sperm kursuskapacitering11,12,13,14, er bidraget fra oxphos mindre klart. I modsætning til andre celletyper, hvor glycolyse er fysisk koblet til TCA-cyklussen, er sperm stærkt opdelte og menes at vedligeholde disse processer i separate flagellar rum: Mellemstykket koncentrerer mitokondrie maskiner, mens de vigtigste enzymer af glykolyse synes at være begrænset til det vigtigste stykke15,16. Denne opdeling resulterer i en løbende debat om, hvorvidt pyruvat fremstillet i hovedstykket af glycolyse kan understøtte mitokondrie oxphos i midterstykket, og om ATP produceret af oxphos i midterstykket ville være i stand til at diffus tilstrækkeligt hurtigt langs længden af flagel til at understøtte energibehovet i distale dele af hovedstykket17,18,19. Der er også støtte til en rolle for oxphos i sperm capacitation. Ikke alene er oxphos mere energetisk gunstig end glycolyse, genererer 16 gange mere ATP end glycolyse, men mellemstykke volumen og mitokondriel indhold er direkte korreleret med reproduktiv egnethed i pattedyrarter, som udviser større grader af konkurrence mellem mænd for hjælpere20. Behandling af disse spørgsmål kræver metoder til at undersøge de relative bidrag af glycolyse og oxphos under sædcapacitation.
Tourmente et al. anvendte en 24-brønd ekstracellulær flux analysator til at sammenligne energimetabolisme af nært beslægtede mus arter med signifikant forskellige sædkvalitet parametre21. I stedet for at rapportere basal ECAR og OCR værdier af ikke-kondenseret sperm, her, vi tilpasser deres metode ved hjælp af en 96-godt ekstracellulær flux analysator til at overvåge ændringer i energimetabolisme under musen sperm kursuskapacitering i realtid. Vi udviklede en metode, der muliggør samtidig overvågning af glycolyse og oxphos i realtid i sædceller med slå flageller i op til tolv forskellige eksperimentelle betingelser ved at måle flux af ilt (O2) og protoner (H+) (figur 1a). På grund af nedbrydningen af pyruvat til laktat under glykolyse og produktion af CO2 via TCA-cyklus, ikke-kondenseret og kondenseret sperm Extrude h+ ind i analyse mediet, som detekteres af den ekstracellulære flux analysator via H+-følsomme fluorophorer immobiliseret til probespidsen af en sensor patron. Parallelt hermed detekteres O2 forbrug ved oxidativ fosforylering via o2-følsomme fluorophorer immobiliseret til samme sonde spids (figur 1b). Effektiv påvisning af den frigivne H+ og forbrugt O2 kræver en modificeret sperm buffer med lav bufferkapacitet uden bicarbonat eller phenol rød. Således, at inducere kursuskapacitering i fravær af bicarbonat, vi vedtog brugen af en celle gennemtrængelig lejr analog injiceres sammen med bredspektret PDE inhibitor ibmx22. Tre yderligere uafhængige Indsprøjtnings porte tillader injektion af farmakologiske aktivatorer og/eller hæmmere, hvilket letter realtids påvisning af ændringer i cellulær respiration og glykolyse hastighed på grund af eksperimentel manipulation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tabet af sædcapacitation i fravær af visse metaboliske substrater eller kritiske metaboliske enzymer afslørede energimetabolisme som en nøglefaktor, der støtter vellykket befrugtning. En metabolisk switch under celle aktivering er et veletableret koncept i andre celletyper, men vi er lige begyndt at forstå, hvordan sædceller tilpasser deres metabolisme til den stigende energiefterspørgsel under capacitation. Ved hjælp af en ekstracellulær flux analysator, vi udviklet et let anvendeligt værktøj til at overvåg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu på Rockefeller High gennemløb og spectroscopy Resource Center.
Materials
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
References
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
- Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).
- de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
- Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).
- Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).
- Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).
- Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).
- Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
- Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O’Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).
- Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).
- Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).
- Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).
- Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).
- Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).
- Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).
- Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).
- Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).
- Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).
- Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).
- Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).
- Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).
- Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).
