세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 글리코용해 및 산화 인산화의 변화를 측정합니다.
Summary
우리는 마우스 정자 capacitation 도중 당해 및 산화 인산화에 있는 실시간 변경을 감시하기 위하여 세포외 플럭스 분석기의 응용을 기술합니다.
Abstract
포유류 정자는 capacitation로 알려져 있는 프로세스에 있는 여성 생식 기관에 있는 풍부하게 함 용량을 취득합니다. 정전 관련 공정에는 에너지가 필요합니다. 정자 진보적 인 운동성 연료 ATP를 생성하는 소스에 대한 지속적인 논쟁이 남아있다, 용량, 과소 활성화, 및 곡예 반응. 여기에서, 우리는 마우스 정액 capacitation 도중 에너지 물질 대사에 있는 변경을 분석하는 공구로 세포외 플럭스 분석기의 응용을 기술합니다. H+및O2– 민감한 형광을 사용하여, 이 방법은 비 커패시타이드 대 정전 용량 정자에서 실시간으로 글리코용및 산화 인산화를 모니터링할 수 있게 합니다. 다른 에너지 기판 및 /또는 약리 활성제 및 / 또는 억제제의 존재에서이 분석법을 사용하여 다른 대사 경로의 기여와 정자 capacitation 동안 신호 캐스케이드와 신진 대사 사이의 교차점에 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
Introduction
질량 분석법의 적용은 신진 대사의 연구에 혁명을 일으켰습니다. 표적 대사 프로파일링 및 대사체 추적을 통해 에너지 대사 의 변화를 정밀하게 모니터링할 수 있습니다. 그러나 대사체학을 성공적으로 수행하려면 광범위한 교육, 숙련된 직원, 고가의 고감도 질량 분석기가 모든 실험실에서 쉽게 구할 수 없습니다. 최근에는 해마 XFe96과 같은 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 다양한 세포 유형1,2,3,4,5에서에너지 대사의 변화를 측정하는 대리 방법으로 인기를 끌고 있다.
정자는 고도로 전문화된 운동성 세포입니다; 그의 임무는 난모세포에 친자 게놈을 전달하는 것입니다. 사정 후 남성 생식 기관을 떠나는 정자는 여전히 기능적으로 미숙하며 난모세포의 조끼를 관통할 수 없기 때문에 난모세포를 비옥하게 할 수 없습니다. 정자는충혈6,7로알려진 성숙 과정에서 여성 생식기관을 통과하면서 수정 능력을 습득한다. 갓 사정된 정자 또는 고다 부고환에서 해부된 정자는Ca2+및 중탄산염(HCO3-)또는 세포 투과성 cAMP 아날로그(예를 들어, dibutyryl-cAMP), 콜레스테롤 수용자 (예를 들어, 소 혈청 알부민, BSA), 및 에너지 원 (예를 들어, 포도당). capacitation 도중, 정액은 과활성화8,9에게불린 수영 모드를 나타내는 비대칭 편모 박동으로 그들의 운동성 패턴을 수정하고, 그(것)들은 곡예 반응7을겪을 수 있는 유능한 되고, 여기서 proteolytic 효소는 oocytes의 조끼를 소화하는 풀어 놓입니다. 이러한 과정은 에너지를 필요로 하고, 체세포와 유사하게, 정자는 당해용해뿐만 아니라 미토콘드리아 TCA 주기 및 산화 인산화(oxphoylation)10을통해 ATP 및 기타 고에너지 화합물을 생성한다. 여러 연구는 당해가 정자 capacitation11,12,13,14를지원하기에 필요하고 충분하다는 것을 입증하는 동안, 옥스포스의 기여는 덜 분명하다. 글리콜리시스가 TCA 주기에 물리적으로 결합되는 다른 세포 유형과는 달리, 정자는 고도로 구획화되고 별도의 편모 구획에서 이러한 과정을 유지하는 것으로 생각됩니다: 미드피스는 미토콘드리아 기계를 농축하는 반면, 글리콜리시스의 주요 효소는 주요 조각15,16으로제한되는 것으로 보입니다. 이러한 구획화는 글리코분해에 의해 주체에서 생산된 피루브산이 미드피스에서 미토콘드리아 옥스포스를 지원할 수 있는지, 그리고 미드피스에서 옥스포스에 의해 생성된 ATP가 주체17,18, 19의원단 부분에서 에너지 요구 사항을 지원하기 위해 깃넬럼의 길이를 따라 충분히 빠르게 확산될 수 있는지에 대한 지속적인 논쟁을 낳는다. 또한 정자 capacitation에 oxphos에 대 한 역할의 지원이 있다. 옥스포스는 글리콜리시스보다 16배 더 많은 ATP를 생성할 뿐만 아니라, 중간 체량과 미토콘드리아 함량은 포유류 종의 생식 적합성과 직접적으로 상관관계가 있으며, 이는짝20의경우 남성간의 경쟁이 더 치열합니다. 이 질문을 해결하는 것은 정액 capacitation 도중 glycolysis와 oxphos의 상대적인 기여를 검토하기 위한 방법을 요구합니다.
Tourmente 등은 24웰 세포외 플럭스 분석기를 적용하여 현저히 다른 정자 성능파라미터(21)와밀접하게 관련된 마우스 종의 에너지 대사를 비교한다. 비 정전 용량 정자의 기저 ECAR 및 OCR 값을보고하는 대신, 여기에서, 우리는 실시간으로 마우스 정자 capacitation 동안 에너지 대사의 변화를 모니터링하기 위해 96 잘 세포 외 플럭스 분석기를 사용하여 자신의 방법을 적응. 산소(O2)와 양성자(H+)의 유속을 측정하여 최대 12개의 다른 실험 조건에서 기모를 이겨내며정자에서 글리코용해와 옥스포스를 실시간으로 모니터링할 수 있는 방법을 개발하였다(그림1A). Glycolysis 동안 젖산질화에 대한 피루브산염의 고장으로 인해 TCA 사이클을 통해CO2의 생산, 비-커패시테이트 및 정전 용량 정자 돌출 H+는 H+민감한 형광을 통해 세포 외 플럭스 분석기에 의해 검출되는 분석 매체내로 센서 카트리지의 프로브 팁에 고정된다. 병행하여, 산화인산화에 의한O2 소비는 동일한 프로브 팁에 고정화된O2-민감성형광체를 통해 검출된다(도1B). 방출된H+와 소비된O2의 효과적인 검출은 중탄산염 또는 페놀 적색 없이 낮은 완충 용량을 가진 수정된 정자 완충을 필요로 한다. 따라서, 중탄산염의 부재에서 의 한축을 유도하기 위해, 우리는 광범위 PDE 억제제 IBMX22와함께 주입된 세포 투과성 cAMP 아날로그의 사용을 채택했다. 3개의 추가 독립적인 주입 포트는 약리활성제 및/또는 억제제를 주입할 수 있게 해주며, 이를 통해 실험 조작으로 인한 세포 호흡 및 당해 비율의 변화를 실시간으로 감지할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
특정 신진 대사 기질 또는 중요한 신진 대사 효소의 부재에 있는 정액 capacitation의 손실은 성공적인 풍부하게 함을 지원하는 중요한 요인으로 에너지 물질 대사를 밝혔습니다. 세포 활성화 도중 신진 대사 스위치는 그밖 세포 모형에 있는 잘 확립된 개념입니다, 그러나, 우리는 정액이 capacitation 도중 증가하는 에너지 수요에 그들의 물질 대사를 적응하는 방법을 이해하기 시작했습니다. 세포외 플?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 록펠러 높은 처리량 및 분광학 자원 센터에서 박사 라보이시에 라모스 -Espiritu의 지원을 인정하고자합니다.
Materials
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
References
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