RNA-Seq 분석에 의한 인간 1차 각질 세포의 생체외 분화 의 특성화
Summary
여기에 제시된 RNA-seq 분석에 의한 분자 수준에서의 특성화에 의해 접촉 억제에 의한 인간 1차 각질 세포의 체외 분화를 위한 단계별 절차이다.
Abstract
인간 1 차 각질 세포는 표피 분화 및 관련 질병에 대한 연구를위한 시험관 내 모델로 자주 사용됩니다. 다양한 유도 조건을 이용하여 2차원(2D) 침수 된 매너로 배양된 각질 세포의 체외 분화를 위한 방법이 보고되었다. 여기에 기재된 시험관내 각질 세포 분화 방법에 대한 절차는 RNA-seq에 의한 접촉 억제 및 후속 분자 특성화에 의한 것입니다. 간단히 말해서, 각질 세포는 완전히 수렴될 때까지 성장 요인으로 보충되는 정의된 각질 세포 배지에서 재배됩니다. 분화는 각질 세포 사이의 긴밀한 접촉에 의해 유도되고 매체에서 성장 인자를 배제함으로써 더욱 자극된다. RNA-seq 분석을 사용하여, 1) 분화된 각질 세포는 분화 도중 뚜렷한 분자 서명을 나타내고 2) 동적 유전자 발현 패턴은 표피 계층화 도중 세포를 크게 닮은 것으로 나타났다. 일반적인 각질 세포 분화에 비교하는 것과 관해서는, 전사 인자 p63의 돌연변이를 운반하는 각질 세포는 그들의 분화 결함과 일치하여 변경된 형태학 및 분자 서명을 나타낸다. 결론적으로, 이 프로토콜은 RNA-seq 데이터의 생물정보 분석에 중점을 두고 2D 내 각질 세포 분화 및 분자 특성화를 위한 단계를 자세히 설명합니다. RNA 추출 및 RNA-seq 절차는 잘 문서화되었기 때문에, 이 프로토콜의 초점이 아닙니다. 체외 각막 세포 분화 및 생물 정보 분석 파이프 라인의 실험 절차는 건강하고 병이 있는 각질 세포에서 표피 분화 도중 분자 사건을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
인간의 피부에서 유래된 인간 1차 각질세포는 표피1,2,3,4의생물학을 연구하기 위해 세포 모델로 자주 사용된다. 표피의 계층화는 2D 침수 단층 패션 또는 3D 공기 리프트 organotypic 모델2,3,5,6,7에서각질 세포 분화에 의해 모델링 될 수 있습니다. 3D 모델은 표피 구조와 기능을 평가하는 것이 점점 더 중요해지고 있지만, 2D 분화 모델은 여전히 널리 사용되고 있습니다.
혈청, 고농도 칼슘, 저온 및 표피 성장 인자 수용체2,3의억제를 포함하여 2D에서 각질 세포 분화를 유도하는 다양한 조건이 적용되었다. 이들 각각의 방법은 다수의 각질 세포 분화 마커 유전자에 의해 검증되었으며 병리학적 조건 하에서 케라틴 세포 분화를 평가하는 데 효과적인 것으로 나타났다. 그러나, 이러한 유도 조건은 마커 유전자의 특정 패널이검사될때 그들의 분화 효율 및 운동학에 있는 다름을2,3를보여줍니다.
이러한 방법 중 하나는 배양 배지8에서성장 인자의 각질 세포 접촉 억제 및 고갈을 포함한다. 세포가 전체 밀도에 도달할 때 각질 세포가 자발적으로 분화할 수 있음을 보여주었습니다. 배양 배지의 성장 요인을 제외하면 차별화를 더욱 향상시킬 수 있습니다. 접촉 억제 및 고갈성장 인자를 결합하는 방법은 여러 표피 마커3을사용할 때 정상 계층화 표피와 유사한 유전자 발현 패턴과 분화된 각질 세포체를 생성하는 것으로 나타났으며, 이 모델은 정상 각질 세포 분화를 연구하는 데 적합하다는 것을 시사한다. 최근에는 본 모델을 이용한 각질 세포 분화의 2개의 포괄적인 유전자 발현 분석이9,10으로보고되었다. 연구원은 분자 수준에서 이 모형을 확인하고 정상및 병은 각질 세포 분화를 공부하는 것을 이용될 수 있다는 것을 보여주었습니다.
이 프로토콜은 RNA-seq를 사용하여 분화 된 세포의 체외 분화 방법 및 분자 분석에 대한 절차를 설명합니다. 또한 분화일 0(증식 단계), 2일차, 4일, 7일(각각 조기, 중, 후기 분화)에 대한 세포의 전사의 특성화를 보여 준다. 분화 된 각질 세포가 표피 계층화 중에 세포를 크게 닮은 유전자 발현 패턴을 표시하는 것으로 나타났습니다. 이 방법이 피부 병리학을 연구하는 데 사용될 수 있는지 여부를 조사하기 위해 동일한 실험 및 분석 파이프 라인을 적용하여 방황, 이장 물 분비증 및 갈라진 입술 / 미각 증후군 (EEC) 증후군11,12를가진 환자로부터 파생된 전사 인자 p63의 돌연변이를 운반하는 각질 세포를 조사했습니다. 이 프로토콜은 각질 세포의 체외 분화뿐만 아니라 RNA-seq의 후속 생물 정보 분석에 초점을 맞추고 있습니다. RNA 추출, RNA-seq 샘플 준비 및 라이브러리 구조와 같은 완전한 절차의 다른 단계는 잘 문서화되어 있으며 특히 일반적으로 사용되는 많은 상용 키트를 사용할 때 쉽게 따를 수 있습니다. 따라서 이러한 단계는 프로토콜에 간단히 설명됩니다. 데이터는 이 파이프라인이 건강하고 병에 걸린 각질 세포에서 표피 분화 도중 분자 사건을 연구하는 데 적합하다는 것을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 작품은 RNA-seq 분석을 사용하여 인간 각질 세포 분화 및 후속 특성화를 유도하는 방법을 설명합니다. 현재 문헌에서는, 인간 각질세포분화에 대한 많은 연구가 2,3,23의분화를 유도하는 방법으로높은 칼슘 농도 또는 혈청을 사용하는 두 가지 다른 방법을 사용한다. 이전 보고서는 이 세 가지 다른 방법3을 신?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 과학 연구를위한 네덜란드 조직에 의해 지원되었다 (NWO / ALW / MEERVOUD / 836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/오픈 대회/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); 라드부 드 대학 펠로우십 (H.Z.); 중국장학원 교부금 201406330059(J.Q.).
Materials
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2929BA | |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| CFX96 Real-Time system | Bio-Rad | qPCR machine | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Ethanolamine >= 98% | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| High Sensitivity DNA chips | Agilent | 5067-4626 | |
| Hydrocortison | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Insulin | Lonza | Part of the bulletKit | |
| iQ SYBR Green Kit | BioRad | 170-8886 | |
| iScript cDNA synthesis | Bio rad | 1708890 | |
| KAPA Library Quant Kit | Roche | 07960255001 | Low concentration measure kit |
| KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase | Roche | KK8540 | RNAseq kit |
| KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Nanodrop | deNovix | DS-11 FX (model) | Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements |
| NEXTflex DNA barcodes -24 | Illumnia | NOVA-514103 | 6 bp long primers |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 |
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