Karakterisering av In Vitro differensiering av humane primære keratinocytter ved RNA-Seq Analyse

Summary

Presentert her er en trinnvis prosedyre for in vitro differensiering av humane primære keratinocytter ved kontakthemming etterfulgt av karakterisering på molekylært nivå ved RNA-seq analyse.

Abstract

Humane primære keratinocytter brukes ofte som in vitro-modeller for studier på epidermal differensiering og relaterte sykdommer. Metoder er rapportert for in vitro differensiering av keratinocytter dyrket i todimensjonale (2D) nedsenket manerer ved hjelp av ulike induksjonsforhold. Beskrevet her er en prosedyre for 2D in vitro keratinocytt differensieringsmetode ved kontakthemming og påfølgende molekylær karakterisering av RNA-seq. Kort sagt, keratinocytter dyrkes i definert keratinocytt medium supplert med vekstfaktorer til de er helt samløpet. Differensiering induseres av nære kontakter mellom keratinocytter og ytterligere stimulert ved å ekskludere vekstfaktorer i mediet. Ved hjelp av RNA-seq analyser, er det vist at begge 1) differensierte keratinocytter viser distinkte molekylære signaturer under differensiering og 2) det dynamiske genuttrykksmønsteret ligner i stor grad celler under epidermal stratifisering. Som for sammenligning med normal keratinocytt differensiering, keratinocytter bærer mutasjoner av transkripsjonsfaktor p63 viser endret morfologi og molekylære signaturer, i samsvar med deres differensiering defekter. Til slutt beskriver denne protokollen trinnene for 2D in vitro keratinocyttdilateriering og molekylær karakterisering, med vekt på bioinformatisk analyse av RNA-seq-data. Fordi RNA-ekstraksjon og RNA-seq prosedyrer har blitt godt dokumentert, er det ikke fokus for denne protokollen. Den eksperimentelle prosedyren for in vitro keratinocyttdilateriering og bioinformatisk analyserørledning kan brukes til å studere molekylære hendelser under epidermal differensiering i sunne og syke keratinocytter.

Introduction

Humane primære keratinocytter avledet fra den menneskelige huden brukes ofte som en cellulær modell for å studere biologien til epidermis^1,2,3,4. Stratifiseringen av epidermis kan modelleres av keratinocytt differensiering, enten i en 2D nedsenket monolayer mote eller 3D luftløft organotypisk modell^2,3,5,6,7. Selv om 3D-modeller har blitt stadig viktigere for å vurdere epidermal struktur og funksjon, er 2D differensieringsmodeller fortsatt mye brukt, på grunn av deres bekvemmelighet og muligheten til å generere et stort antall celler for analyser.

Ulike forhold har blitt brukt for å indusere keratinocytt differensiering i 2D, inkludert tilsetning av serum, høy konsentrasjon av kalsium, lavere temperatur og hemming av epidermal^{vekstfaktorreseptorer 2,3}. Hver av disse metodene har blitt validert av en rekke keratinocytt differensieringsmarkørgener og vist seg å være effektive for å vurdere keratinocyttdilatering, inkludert under patologiske forhold. Disse induksjonsforholdene viser imidlertid også forskjeller i differensieringseffektivitet og kinetikk når spesifikke paneler av markørgener^{undersøkes 2,3}.

En av disse metodene innebærer keratinocyte kontakthemming og uttømming av vekstfaktorer i kulturmediet⁸. Det har vist seg at keratinocytter kan differensiere spontant når cellene når full tetthet.  Å ekskludere vekstfaktorer i kulturmediet kan ytterligere styrke differensieringen. Metoden som kombinerer kontakthemming og nedbrytende vekstfaktorer har vist seg å generere differensierte keratinocytter med genuttrykksmønstre som ligner på den normale stratifiserte epidermis når du bruker flere epidermale markører³, noe som tyder på at denne modellen er egnet for å studere normal keratinocyttdifferensiering. Nylig har to omfattende genuttrykksanalyser av keratinocyttdilateriering ved hjelp av denne modellen blitt^{rapportert 9,10}. Forskere validerte denne modellen på molekylært nivå og viste at den kan brukes til å studere normal og syk keratinocyttdilateriering.

Denne protokollen beskriver prosedyren for in vitro differensieringsmetoden og molekylær analyse av differensierte celler ved hjelp av RNA-seq. Det illustrerer også karakterisering av transkripsjon av celler på differensiering dag 0 (spredning stadium), dag 2, dag 4, og dag 7 (tidlig, midten, og sen differensiering, henholdsvis). Det er vist at differensierte keratinocytter viser genuttrykksmønstre som i stor grad ligner celler under epidermal stratifisering. For å undersøke om denne metoden kan brukes til å studere hudpatologi, brukte vi den samme eksperimentelle og analyserørledningen for å undersøke keratinocytter som bærer mutasjoner av transkripsjonsfaktoren p63 som er avledet fra pasienter med ectrodactyly, ectodermal displasia og kløft leppe / gane (EEC)^{syndrom 11,12}. Denne protokollen fokuserer på in vitro differensiering av keratinocytter samt påfølgende bioinformatisk analyse av RNA-seq. Andre trinn i den komplette prosedyren som RNA-ekstraksjon, RNA-seq prøveklargjøring og bibliotekkonstruksjon, er godt dokumentert og kan enkelt følges, spesielt når du bruker mange vanlige kommersielle sett. Derfor er disse trinnene bare kort beskrevet i protokollen. Dataene viser at denne rørledningen er egnet for å studere molekylære hendelser under epidermal differensiering i sunne og syke keratinocytter.

Protocol

Hudbiopsier ble tatt fra stammen av friske frivillige eller pasienter med p63 mutasjoner, for å sette opp den primære keratinocyttkulturen. Alle prosedyrer for etablering av menneskelige primære keratinocytter ble godkjent av den etiske komiteen ved Radboud University Nijmegen Medical Centre (“Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen”). Informert samtykke ble innhentet. 1. Human primær keratinocytt differensiering ved kontakthemming Forbered keratinocyttvekstmedium (KGM) …

Representative Results

Normal keratinocyttdilatering og RNA-seq-analyseI dette eksperimentet ble keratinocyttlinjer avledet fra fem personer brukt til differensiering og RNA-seq analyser. Figur 1 oppsummerer den eksperimentelle prosedyren for differensiering og RNA-seq analyseresultater. En oversikt over in vitro differensieringsprosedyrer for normale keratinocytter og cellemorfologiendringer under differensiering er illustrert i figur 1A. Prinsippkomponentanalyse…

Discussion

Dette arbeidet beskriver en metode for å indusere menneskelig keratinocytt differensiering og påfølgende karakterisering ved hjelp av RNA-seq analyser. I dagens litteratur bruker mange studier på human keratinocyttdilateriering to andre metoder, med høy kalsiumkonsentrasjon eller med serum som metoder for å indusere differensiering^2,3,23. En tidligere rapport nøye sammenlignet disse tre forskjellige^metod…

Materials

Bioanalyzer 2100	Agilent	G2929BA
Bovine pituitary extract (BPE)	Lonza		Part of the bulletKit
CFX96 Real-Time system	Bio-Rad		qPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Epidermal Growth Factor (EGF)	Lonza		Part of the bulletKit
Ethanolamine >= 98%	Sigma-Aldrich	E9508
High Sensitivity DNA chips	Agilent	5067-4626
Hydrocortison	Lonza		Part of the bulletKit
Insulin	Lonza		Part of the bulletKit
iQ SYBR Green Kit	BioRad	170-8886
iScript cDNA synthesis	Bio rad	1708890
KAPA Library Quant Kit	Roche	07960255001	Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase	Roche	KK8540	RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit	Lonza	192060
Nanodrop	deNovix	DS-11 FX (model)	Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24	Illumnia	NOVA-514103	6 bp long primers
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513