Verwendung von mehrschichtigem Hydrogel Bioink im dreidimensionalen Bioprinting für homogene Zellverteilung
Summary
Hier haben wir eine neuartige mehrschichtige modifizierte Strategie für flüssigkeitsähnliche Bioinken (Gelatinemethacryloyl mit niedriger Viskosität) entwickelt, um die Sedimentation von verkapselten Zellen zu verhindern.
Abstract
Während des extrusionsbasierten dreidimensionalen Bioprinting-Prozesses können flüssigkeitsähnliche Bioinken mit geringer Viskosität Zellen vor Membranschäden schützen, die durch Scherspannung verursacht werden, und das Überleben der verkapselten Zellen verbessern. Eine schnelle gravitationsgetriebene Zellsedimentation im Reservoir könnte jedoch zu einer inhomogenen Zellverteilung in biobedruckten Strukturen führen und somit die Anwendung flüssigkeitsähnlicher Bioinks behindern. Hier haben wir eine neuartige mehrschichtige modifizierte Strategie für flüssigkeitsähnliche Bioinken (z.B. Gelatinemethacryloyl mit niedriger Viskosität) entwickelt, um die Sedimentation verkapselter Zellen zu verhindern. Mehrere flüssigkeitsnahe Schnittstellen wurden im vielschichtigen Bioink manipuliert, um die Grenzflächenretention zu gewährleisten. Folglich wurde die Zellsedimentationswirkung, die sich über benachbarte Schichten im mehrschichtigen System erstreckte, im Bioinkreservoir verzögert. Es wurde festgestellt, dass die Grenzflächenretention viel höher war als die Sedimentzugvon Zellen, was eine entscheidende Rolle der Grenzflächenretention bei der Verhinderung von Zellsedimentation und der Förderung einer homogeneren Dispersion von Zellen im vielschichtigen Bioink zeigt.
Introduction
Der dreidimensionale (3D) Bioprinting war eine vielversprechende Methode zur Herstellung komplexer architektonischer und funktioneller Nachbildungen von nativen Geweben in der Biofabrikation und regenerativen Medizin1,2,3. Die gängigen Strategien des Bioprintings, einschließlich Inkjet-, Extrusions- und Stereolithographiedruck, haben Vor- und Nachteile aus verschiedenen Perspektiven4. Unter diesen Techniken wird das Extrusionsverfahren aufgrund seiner Wirtschaftlichkeit am häufigsten verwendet. Bioink spielt eine Schlüsselrolle bei der Prozessstabilität des Extrusionsbioprintings. Der ideale zellbeladene Bioink sollte nicht nur biokompatibel, sondern auch für mechanischeEigenschaften5 geeignet sein. Bioinks mit niedriger Viskosität werden in der Regel als flüssigkeitsähnlicher Zustand dargestellt. Diese Bioinks können einfach und schnell abgelagert werden und zellmembranbedingte Schäden vermeiden, die durch hohe Scherspannung während der Extrusion verursacht werden. In komplexen Fällen, die langfristige Druckzeiten erfordern, führt jedoch eine niedrige Viskosität häufig zur unvermeidlichen Sedimentation der verkapselten Zellen im Bioinkreservoir, die in der Regel durch die Schwerkraft angetrieben wird und zu einer inhomogenen Zelldispersion im Bioinkführt 6,7. Folglich behindert ein Bioink mit inhomogener Zelldispergität den In-vitro-Bioprinting eines funktionellen Gewebekonstrukts.
Mehrere neuere Studien, die sich auf Bioinks konzentrieren, haben die Förderung der homogenen Dispergität von verkapselten Zellen berichtet. Für den Extrusionsbioprinting8wurde ein modifizierter Alginatbioink auf Basis einer zweistufigen Vernetzung verwendet. Ein Alginatpolymer wurde in dieser Studie mit Peptiden und Proteinen modifiziert. Zellen zeigten eine homogenere Verteilung in diesem modifizierten Alginat als in dem häufig verwendeten Alginat aufgrund der Anbaustellen, die von den Peptiden und den Proteinen bereitgestellt werden. Alternativ wurden gemischte Bioinks verwendet, um die Sedimentation von Zellen in Bioink zu lösen. In einer weiteren Studie wurde ein gemischter Bioink mit Polyethylenglykol (PEG) und Gelatine- oder Gelatinemethacryloyl (GelMA) mit verbesserter mechanischer Robustheit verwendet9. Die gekapselten Zellen zeigten eine homogene Verteilung vor allem, weil die Viskosität des gemischten Bioinks verbessert wurde. Im Allgemeinen gibt es mehrere Faktoren, die die Dispergität der verkapselten Zellen im Bioink beeinflussen, wie die Viskosität des Bioinks, die Schwerkraft der Zellen, die Dichte der Zellen und die Dauer der Arbeitszeit. Unter diesen Faktoren spielt die Schwerkraft von Zellen eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Sedimentation. Der Auftrieb und die Reibung, die der zähflüssige Bioink bietet, wurden bisher als Hauptkräfte gegen die Schwerkraft untersucht10.
Hierbei haben wir eine neuartige Strategie entwickelt, um die homogene Dispergität der verkapselten Zellen in Bioink zu fördern, indem wir mehrere flüssige Schnittstellen im Bioink-Reservoir manipulieren. Diese flüssigen Schnittstellen, die durch die vielschichtige Modifikation des Bioinks entstehen, können nicht nur grenzflächenretentionsfähig sein, was die Sedimentation von Zellen verzögert, sondern auch eine geeignete Biokompatibilität und rheologisches Verhalten des Bioinks aufrechterhalten. In der Praxis haben wir die wässrige GelMA-Lösung (5%, w/v) mit Seidenfibroin (SF) in vielschichtiger Weise modifiziert, um längs vier Schnittstellen zu erzeugen, die Grenzflächenspannungen im gemischten Bioink erzeugen. Dadurch wurde die Schwerkraftbelastung der Zellen durch die vom Menschen hergestellte Grenzflächenspannung kompensiert, und eine nahezu homogene Dispersion der verkapselten Zellen im Bioink wurde durch weniger Sedimentation über die angrenzenden Zellschichten hinweg erzielt. Bisher wurde kein ähnliches Protokoll zur Verlangsamung der Sedimentation von verkapselten Zellen durch Manipulation der Grenzflächenretention in flüssigen Bioinks berichtet. Wir stellen hier unser Protokoll vor, um eine neue Möglichkeit zur Lösung der Zellsedimentation im Bioprinting aufzuzeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Stabilität des mehrschichtigen Systems ist ein wichtiger Punkt, um dieses Protokoll erfolgreich auszuführen. Theoretisch berechneten wir die Diffusion von SF-Molekülen in der GelMA-Lösung auf Basis von Naumans Studie13. Es wurde festgestellt, dass die Diffusion von Proteinen in Lösung mit ihrem Molekulargewicht zusammenhängt. Das durchschnittliche Molekulargewicht (MW) des Rinderserumalbumins (BSA) beträgt 66,5 kDa und sein Diffusionskoeffizient liegt bei 64-72 m2/s. Der durc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen Stipendien der National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 und 81570422), National Key F&E-Programm chinas (2018YFC1005002), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17JC1400200), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (Grant No. 2017SHZDZX01) und Shanghai Municipal Education Commission (Innovationsprogramm 2017-01-07-00-07-E00027).
Materials
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
