Utilisation de Bioink Hydrogel multicouches dans la bioimpression tridimensionnelle pour la distribution homogène des cellules
Summary
Ici, nous avons développé une nouvelle stratégie modifiée à plusieurs niveaux pour les bioinks liquides (gélatine méthacryloyl à faible viscosité) pour empêcher la sédimentation des cellules encapsulées.
Abstract
Pendant le processus de bioimpression tridimensionnell à base d’extrusion, les bioinks liquides à faible viscosité peuvent protéger les cellules contre les dommages membranaires induits par le stress de cisaillement et améliorer la survie des cellules encapsulées. Toutefois, la sédimentation cellulaire rapide par gravité dans le réservoir pourrait entraîner une distribution inhomogène des cellules dans les structures bioimprimées et donc entraver l’application de bioinks semblables à des liquides. Ici, nous avons développé une nouvelle stratégie modifiée à plusieurs niveaux pour les bioinks liquides (p. ex., le méthacryloyl gélatineux à faible viscosité) pour prévenir la sédimentation des cellules encapsulées. Plusieurs interfaces liquides ont été manipulées dans le bioink multicouches pour fournir la rétention interfaciale. Par conséquent, l’action de sédimentation cellulaire qui traverse les couches adjacentes du système à plusieurs niveaux a été retardée dans le réservoir de bioink. Il a été constaté que la rétention interfaciale était beaucoup plus élevée que l’attraction sédimentaire des cellules, démontrant un rôle critique de la rétention interfaciale dans la prévention de la sédimentation cellulaire et la promotion d’une dispersion plus homogène des cellules dans le bioink multicouches.
Introduction
La bioimpression tridimensionnelle (3D) a été une méthode prometteuse pour fabriquer des répliques architecturales et fonctionnelles complexes de tissus indigènes en biofabrication et en médecine régénérative1,2,3. Les stratégies communes de bioimpression, y compris l’impression à jet d’encre, extrusion et stéréolithographie, ont des avantages et des inconvénients de différentes perspectives4. Parmi ces techniques, la procédure d’extrusion est le plus couramment utilisée en raison de son rapport coût-efficacité. Bioink joue un rôle clé dans la stabilité du processus de bioimpression de l’extrusion. Le bioink idéal chargé de cellules doit non seulement être biocompatible, mais aussi être adapté aux propriétés mécaniques5. Les bioinks à faible viscosité sont généralement présentés comme un état liquide. Ces bioinks peuvent être facilement et rapidement déposés et éviter les dommages à la membrane cellulaire induits par un stress de cisaillement élevé pendant l’extrusion. Cependant, dans les cas complexes nécessitant des périodes d’impression à long terme, la faible viscosité donne souvent lieu à la sédimentation inévitable des cellules encapsulées dans le réservoir de bioink, qui est habituellement entraîné par la gravité et conduit à une dispersion inhomogène des cellules dans le bioink6,7. Par conséquent, un bioink avec dispersion inhomogeneous de cellules entrave la bioimpression in vitro d’une construction fonctionnelle de tissu.
Plusieurs études récentes portant sur les bioinks ont rapporté la promotion de la dispersion homogène des cellules encapsulées. Un bioink d’alginate modifié basé sur le crosslinking à deux étages a été utilisé pour la bioimpression d’extrusion8. Un polymère d’alginate a été modifié avec des peptides et des protéines dans cette étude. Les cellules ont présenté une distribution plus homogène dans cet alginate modifié que dans l’alginate couramment utilisé en raison des sites d’attachement fournis par les peptides et les protéines. Alternativement, les bioinks mélangés ont été utilisés pour résoudre la sédimentation des cellules dans le bioink. Un bioink mélangé contenant du polyéthylène glycol (PEG) et de la gélatine ou de la gélatine méthacryloyl (GelMA) avec une robustesse mécanique améliorée a été utilisé dans une autre étude9. Les cellules encapsulées ont présenté une distribution homogène principalement parce que la viscosité du bioink mélangé a été améliorée. En général, il existe plusieurs facteurs influençant la dispersion des cellules encapsulées dans le bioink, tels que la viscosité du bioink, la gravité des cellules, la densité des cellules et la durée de la période de travail. Parmi ces facteurs, la gravité des cellules joue un rôle essentiel dans la promotion de la sédimentation. La flottabilité et la friction fournies par le bioink visqueux ont été étudiées comme les principales forces contre la gravité à ce jour10.
Ici, nous avons développé une nouvelle stratégie pour promouvoir la dispersion homogène des cellules encapsulées dans le bioink en manipulant plusieurs interfaces liquides dans le réservoir de bioink. Ces interfaces liquides créées par la modification multicouches du bioink peuvent non seulement fournir une rétention interfaciale, ce qui retarde la sédimentation des cellules, mais aussi maintenir une biocompatibilité appropriée et le comportement rhéologique du bioink. Dans la pratique, nous avons modifié la solution aqueuse GelMA (5%, w/v) avec la fibroine de soie (SF) d’une manière multicouches pour produire longitudinalement quatre interfaces, fournissant des tensions interfaciales dans le bioink mélangé. En conséquence, la charge de gravité sur les cellules a été compensée par la tension interfaciale artificielle, et une dispersion presque homogène des cellules encapsulées dans le bioink a été obtenue en raison de moins de sédimentation à travers les couches adjacentes des cellules. Aucun protocole similaire pour ralentir la sédimentation des cellules encapsulées en manipulant la rétention interfaciale dans les bioinks liquides n’a été rapporté à ce jour. Nous présentons notre protocole ici pour démontrer une nouvelle façon de résoudre la sédimentation cellulaire dans la bioimpression.
Protocol
Representative Results
Discussion
La stabilité du système multicouches est un point clé pour effectuer ce protocole avec succès. Nous avons théoriquement calculé la diffusion des molécules SF dans la solution GelMA sur la base de l’étude de Nauman13. Il a été constaté que la diffusion des protéines dans la solution était liée à leur poids moléculaire. Le poids moléculaire moyen (MW) de l’albumine de sérum bovin (BSA) est de 66,5 kDa, et son coefficient de diffusion est de 64-72 μm2/s. Le MW moyen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent les subventions de la National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 et 81570422), National Key R&D Program of China (2018YFC10050002), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17JC1400200), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (Grant No. 2017SHZDZX01), et Shanghai Municipal Education Commission (Innovation Program 2017-01-07-00-07-E00027).
Materials
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
