Uso de Bioink de hidrogel multicapa en bioimpresión tridimensional para distribución celular homogénea
Summary
Aquí, desarrollamos una novedosa estrategia modificada multicapa para bioenergitis similares a líquidos (gelatina con baja viscosidad) para evitar la sedimentación de células encapsuladas.
Abstract
Durante el proceso de bioimpresión tridimensional basado en la extrusión, los bioenergientes similares a líquidos con baja viscosidad pueden proteger las células del daño de la membrana inducido por el estrés de cizallamiento y mejorar la supervivencia de las células encapsuladas. Sin embargo, la rápida sedimentación celular impulsada por gravedad en el depósito podría conducir a una distribución celular inhomogénea en estructuras bioimpresas y, por lo tanto, obstaculizar la aplicación de bioenergías similares a líquidos. Aquí, desarrollamos una novedosa estrategia modificada multicapa para bioinks similares a líquidos (por ejemplo, metacriloilo de gelatina con baja viscosidad) para evitar la sedimentación de células encapsuladas. Múltiples interfaces líquidas fueron manipuladas en el bioenergía multicapa para proporcionar retención interfacial. En consecuencia, la acción de sedimentación celular que atravesaba capas adyacentes en el sistema multicapa se retrasó en el depósito de bioenlatado. Se encontró que la retención interfacial era mucho mayor que el tirón sedimentario de las células, demostrando un papel crítico de la retención interfacial en la prevención de la sedimentación celular y la promoción de una dispersión más homogénea de células en el bioenlaz multicapa.
Introduction
La bioimpresión tridimensional (3D) ha sido un método prometedor para fabricar réplicas arquitectónicas y funcionales complejas de tejidos nativos en biofabricación y medicina regenerativa1,,2,,3. Las estrategias comunes de bioimpresión, incluyendo inyección de tinta, extrusión e impresión estereolitografía, tienen pros y contras desde diferentes perspectivas4. Entre estas técnicas, el procedimiento de extrusión se utiliza más comúnmente debido a su rentabilidad. Bioink desempeña un papel clave en la estabilidad del proceso de la bioimpresión de extrusión. El bioenlace celular ideal no sólo debe ser biocompatible, sino también adecuado para las propiedades mecánicas5. Los bioinks con baja viscosidad se presentan típicamente como un estado de forma líquida. Estos bioenergiendos se pueden depositar fácil y rápidamente y evitar daños en la membrana celular inducidos por alta tensión de cizallamiento durante la extrusión. Sin embargo, en casos complejos que requieren períodos de impresión a largo plazo, la baja viscosidad a menudo da lugar a la sedimentación inevitable de las células encapsuladas en el depósito de bioenlace, que generalmente es impulsada por la gravedad y conduce a una dispersión celular inhomogénea en el bioenlace6,7. En consecuencia, un bioenlace con dispersión celular inhomogénea obstaculiza la bioimpresión in vitro de una construcción de tejido funcional.
Varios estudios recientes centrados en bioenergicos han reportado la promoción de la dispersión homogénea de células encapsuladas. Para la bioimpresión de extrusión se utilizó un bioenergiente de alginato modificado basado en el reticulación8de doble etapa. Un polímero de alginato fue modificado con péptidos y proteínas en este estudio. Las células presentaban una distribución más homogénea en este alginato modificado que en el alginato comúnmente utilizado debido a los sitios de unión proporcionados por los péptidos y las proteínas. Alternativamente, bioinks mezclados se han utilizado para resolver la sedimentación de células en el bioenergía. En otroestudiose utilizó un bioenlace mezclado que contiene polietilenglicol (PEG) y gelatina o gelatina de metacriloilo (GelMA) con mayor robustez mecánica. Las células encapsuladas presentaban una distribución homogénea principalmente porque se mejoró la viscosidad del bioenergía mezclado. En general, hay varios factores que influyen en la dispersión de las células encapsuladas en el bioendo, como la viscosidad del bioenlociente, la gravedad de las células, la densidad de las células y la duración del período de trabajo. Entre estos factores, la gravedad de las células desempeña un papel crítico en la promoción de la sedimentación. La flotabilidad y fricción proporcionadas por el bioenergía viscosa se han investigado como las principales fuerzas contra la gravedad hasta la fecha10.
Aquí, desarrollamos una estrategia novedosa para promover la dispersión homogénea de las células encapsuladas en el bioenergía mediante la manipulación de múltiples interfaces líquidas en el depósito de bioenergía. Estas interfaces líquidas creadas por la modificación multicapa del bioenlaz no sólo pueden proporcionar retención interfacial, lo que retrasa la sedimentación de las células, sino que también mantienen una biocompatibilidad adecuada y un comportamiento reológico del bioenlatado. En la práctica, modificamos la solución GelMA acuosa (5%, p/v) con fibroína de seda (SF) de forma multicapa para producir longitudinalmente cuatro interfaces, proporcionando tensiones interfaciales en el bioenergía mezclado. Como resultado, la carga por gravedad en las células fue compensada por la tensión interfacial artificial, y se obtuvo una dispersión casi homogénea de las células encapsuladas en el bioenlaz debido a una menor sedimentación a través de las capas adyacentes de las células. Hasta la fecha no se ha notificado ningún protocolo similar para frenar la sedimentación de células encapsuladas manipulando la retención interfacial en bioenquisas líquidas. Aquí presentamos nuestro protocolo para demostrar una nueva forma de resolver la sedimentación celular en la bioimpresión.
Protocol
Representative Results
Discussion
La estabilidad del sistema multicapa es un punto clave para realizar este protocolo con éxito. Teóricamente calculamos la difusión de moléculas SF en la solución GelMA basada en el estudiode Nauman 13. Se encontró que la difusión de proteínas en solución estaba relacionada con su peso molecular. El peso molecular medio (MW) de la albúmina sérica bovina (BSA) es de 66,5 kDa, y su coeficiente de difusión es de 64-72 m2/s. El MW medio de fibrinógeno es de 339,7 kDa, y su coefi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen las subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81771971, 81970442, 81703470 y 81570422), National Key I&D Program of China (2018YFC1005002), Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái (17JC1400200), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (Grant No. 2017SHZDZX01) y Shanghai Municipal Education Commission (Programa de Innovación 2017-01-0 7-00-07-E00027).
Materials
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
