Mikroskopisk mikrofoton observation af fartøjer i muselevervæv
Summary
I dette eksperiment injiceres en mus i halen med Rhodamin B isothiocyanat-dextran, der kan plette blodkar. Efter leveren er eksponeret og fast, en bestemt del af leveren kan vælges til at observere det dybe væv i den levende krop ved hjælp af multiphoton mikroskopi.
Abstract
Overholdelse af den intravaskulære dynamik i muselevervæv giver os mulighed for at foretage yderligere dybdegående observationer og undersøgelser af vævsrelaterede sygdomme i museleveren. En mus injiceres med et farvestof, der kan plette blodkar. For at observere museleveren in vivo udsættes den og fastgøres i en ramme. To og tre-dimensionelle billeder af blodkarrene i levervævet er opnået ved hjælp af et multiphoton mikroskop. Billeder af vævene på de udvalgte steder erhverves løbende for at observere langsigtede ændringer; de dynamiske ændringer af blodkarrene i levervævet observeres også. Multiphoton mikroskopi er en metode til at observere celle- og cellefunktion i dybe vævssektioner eller organer. Multiphoton mikroskopi har følsomhed over for væv mikrostruktur og muliggør billeddannelse af biologiske væv ved høj rumlig opløsning in vivo, hvilket giver mulighed for at fange de biokemiske oplysninger i organisationen. Multiphoton mikroskopi bruges til at observere en del af leveren, men fastsættelse af leveren for at gøre billedet mere stabilt er problematisk. I dette eksperiment bruges en speciel vakuumsugkop til at fikse leveren og opnå et mere stabilt billede af leveren under mikroskopet. Desuden kan denne metode bruges til at observere dynamiske ændringer af specifikke stoffer i leveren ved at markere sådanne stoffer med farvestoffer.
Introduction
Blodkar kan give næringsstoffer til forskellige organvæv i den menneskelige krop, og udveksle stoffer. Samtidig fungerer mange cytokiner, hormoner, lægemidler og celler også gennem vaskulær transport til bestemte steder. Observation vaskulære ændringer i levervæv kan hjælpe med at forstå fordelingen af blodgennemstrømningen i levervæv og transport af stoffer og hjælpe med analysen af visse vaskulære-relaterede sygdomme1,2.
Der er mange måder at observere leverens blodkar på hos mus. Blandt dem har optisk mikroskopi mange begrænsninger i at observere uigennemsigtig vaskulært væv3. Multiphoton mikroskopi kan bruges til at afbilde blodkarrene i levende lever med noninvasive høj opløsning4. Ikke alene kan tre-dimensionelle billeder af blodkar opnås, men teknikken kan også bruges til at hjælpe med at organisere vævet til at observere biologiske virkninger deri; Desuden kan hele vævet afbildes i stedet for kun mikrovesselerne som i computertomografi og magnetisk resonansbilleddannelse5.
Multiphoton mikroskopi kan bruges til effektivt at opdage spredte lysstofrør i dybt levende væv, med mindre fototoksicitet6. Derfor kan aktiviteten af levende væv sikres, og mængden af skader kan reduceres. Multiphoton mikroskopi har bedre gennemtrængende effekt end konfokal mikroskopi, så dybere lag, der skal overholdes7, giver unikke 3D-billedbehandling. Multiphoton mikroskopi bruges nu ofte i billeddiagnostik kranienerver8 og er blevet udvidet til studiet af neuronal dynamik i levende mus9,10,11.
I dette eksperiment, efter fluorescerende mærkning af museblodkar, er leveren fastgjort i en ramme, og dynamikken i blodkarrene i levende levervæv kan ses ved hjælp af multifotonmikroskopi. Dette eksperiment demonstrerer, hvordan man markerer specifikke stoffer, bruger multifotonmikroskopi til at hjælpe med at observere et sted i vævet, observere cellulære begivenheder i det intercellulære væv, foretage fotokemiske målinger12,13,14og observere materialedynamikken inde i det levende væv15. For eksempel, tumor endotel markør 1 (TEM1) er blevet identificeret som en ny overflade markør upreguleret på blodkarrene og stroma i mange faste tumorer, mærkning enkelt-kæde variabel fragment (scFv) 78 mod TEM1, og derefter multiphoton mikroskopi kan bruges til mus hemangioma placering og evaluering af tumorer16.
Protocol
Representative Results
Discussion
At observere et bestemt levende væv er et effektivt middel til at forstå ændringer, lokalisering og biologiske virkninger af materialet inde i vævet17. I dette eksperiment, er de vigtige skridt fastsættelse af leveren med et organ imaging armatur, som kan løse problemet med bevægelse artefakter på grund af vejrtrækning og hjerteslag, og brugen af et multiphoton mikroskop til observation. Ved hjælp af denne metode observeres leverens indre væv in vivo gennem et multifotonmikroskop, og bl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81772133, 81902444), Guangdong Natural Science Fund (2020A1515010269, 2020A1515011367), Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034, 201903010072) og Military Medical Innovation Project (17CXZ008).
Materials
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
