Summary

Un array di gocciole del femtolitro per sintesi proteica massicciamente parallela da molecole di DNA singolo

Published: June 20, 2020
doi:

Summary

L’obiettivo generale del protocollo è quello di preparare oltre un milione di goccioline di femminiter ordinate, uniformi, stabili e biocompatibili su un substrato di 1 cm2 planari che può essere utilizzato per la sintesi proteica priva di cellule.

Abstract

I progressi nella risoluzione spaziale e nella sensibilità di rilevamento della strumentazione scientifica consentono di applicare piccoli reattori per la ricerca biologica e chimica. Per soddisfare la domanda di microreattori ad alte prestazioni, abbiamo sviluppato un dispositivo FemDA (Femtoliter droplet array) ed esemplificato la sua applicazione in reazioni di sintesi proteica senza cellule (CFPS) massicciamente parallele. Più di un milione di goccioline uniformi sono state prontamente generate all’interno di un’area delle dimensioni di un dito utilizzando un protocollo di sigillamento dell’olio in due fasi. Ogni goccia era ancorata in una microcamera femtolare composta da un fondo idrofilo e da una parete laterale idrofobica. La struttura ibrida idrofilo-in-idrofobico e gli oli e i surfactants di tenuta dedicati sono fondamentali per mantenere stabilmente la soluzione femtoliter aqueous nello spazio femtoliter senza perdita di evaporazione. La configurazione femtoliter e la semplice struttura del dispositivo FemDA hanno permesso un consumo minimo di reagenti. La dimensione uniforme dei reattori a goccia ha reso convincenti e affidabili le misurazioni quantitative e temporali su larga scala. La tecnologia FemDA ha correlato la resa proteica della reazione CFPS con il numero di molecole di DNA in ogni goccia. Abbiamo semplificato le procedure relative alla microfabbricazione del dispositivo, alla formazione delle goccioline del femtoltro e all’acquisizione e all’analisi dei dati microscopici dell’immagine. Il protocollo dettagliato con il basso costo di funzionamento ottimizzato rende la tecnologia FemDA accessibile a tutti coloro che hanno impianti standard di pulizia e un microscopio a fluorescenza convenzionale al proprio posto.

Introduction

I ricercatori utilizzano i reattori per eseguire reazioni biochimiche. Ci sono sforzi significativi che sono stati fatti per ridurre le dimensioni del reattore e aumentare la produttività sperimentale al fine di ridurre il consumo di reagente migliorando al contempo l’efficienza del lavoro. Entrambi gli aspetti mirano a liberare i ricercatori da un carico di lavoro pesante, riducendo i costi e accelerando la ricerca e lo sviluppo. Abbiamo una chiara tabella di marcia storica sullo sviluppo delle tecnologie dei reattori dal punto di vista dei volumi di reazione e della produttività: singoli becher/flask/test-tube, tubi milliliter, tubi microliter, nanotubi microliter 8 tubi, microliter 96/384/1536-bene piastra, e reattori microfluidici nanoliter/picoliter/picoliter/11,2,3,4,5,6,7. Analogo al ridimensionamento delle dimensioni delle caratteristiche dei transistor sui chip di circuito integrati nell’industria dei semiconduttori negli ultimi decenni, i microreattori bio/chimici stanno attraversando la riduzione del volume e l’integrazione del sistema. Tali strumenti su piccola scala hanno avuto un profondo impatto sulla biologia sintetica basata su cellule o senza cellule, sulla bioproduzione e sulla prototipazione e lo screening ad alta produttività8,9,10,1111,12. Questo documento descrive il nostro recente sforzo sullo sviluppo di una tecnologia unica di array di gocciolini e dimostra la sua applicazione in CFPS13, una tecnologia fondamentale per la biologia sintetica e le comunità di screening molecolare14. In particolare, forniamo intenzionalmente un protocollo ottimizzato e a basso costo per rendere il dispositivo FemDA accessibile a tutti. Il protocollo a basso costo e facile da gestire per il dispositivo miniaturizzato contribuirebbe agli scopi educativi delle università e contribuirebbe a diffondere la tecnologia.

FemDA prepara le goccioline di femtoter ad una densità ultraelevata di 106 per 1 cm2 su un substrato di vetro planare. Abbiamo rivestito un polimero idrofobico, CYTOP15, sul substrato di vetro e inciso selettivamente (rimosso) CYTOP in posizioni predefinite per generare un array a microcamera sul substrato. Così, la microcamera risultante è composta da una parete laterale idrofobica (CYTOP) e un fondo idrofilo (vetro). Quando scorre in sequenza acqua e olio sulla superficie modellata, l’acqua può essere intrappolata e sigillata nelle microcamere. La struttura idrofila-in-idrofobica è vitale per respingere l’acqua al di fuori delle microcamere, isolare i singoli microreattori e mantenere una piccola soluzione acquosa all’interno dello spazio femtolitro. La proprietà unica è stata applicata con successo per la preparazione di goccioline acqua-in-olio e lipidi bistrato microcomogni16,17. Rispetto al prototipo del dispositivo16,abbiamo prima ottimizzato il processo di microfabbricazione per realizzare una rimozione completa del polimero CYTOP e una completa esposizione del fondo di vetro. CYTOP è un fluoropolimero speciale con una tensione superficiale estremamente bassa (19 mN/m) inferiore a quella dei materiali convenzionali di microreattore come vetro, plastica e silicone. Le sue buone prestazioni ottiche, elettriche e chimiche sono già state utilizzate nel trattamento superficiale di dispositivi microfluidici18,19,20,21,22,23,24. Nel sistema FemDA, per ottenere una buona bagnatura dell’olio sulla superficie CYTOP, la tensione superficiale dell’olio deve essere inferiore a quella della superficie solida25. In caso contrario, l’olio liquido a contatto con la superficie solida tende a diventare sferico piuttosto che diffondersi sulla superficie. Inoltre, abbiamo scoperto che alcuni oli di perfluorocarburi popolari (ad esempio, 3M FC-40)16 e oli idrofluoroetering (ad esempio, serie 3M Novec) possono sciogliere CYTOP a causa della morfologia amorfo di CYTOP, che è fatale per la misurazione quantitativa e sarebbe discutibile in termini di contaminazione incrociata tra le goccioline. Fortunatamente, abbiamo identificato un olio biocompatibile ed ecologico che mostra una tensione superficiale inferiore (< 19 mN/m)13. Abbiamo anche trovato un nuovo surfactant che può sciogliere nell’olio selezionato e funzionare in una bassa concentrazione (0.1%, almeno 10 volte inferiore a quelli precedentemente segnalati popolari26,27)13. L’interfaccia acqua/olio risultante può essere stabilizzata dal surfactant. A causa dell’elevato tasso di evaporazione dell’olio, seguendo il filo con l’olio, abbiamo applicato un altro olio biocompatibile e rispettoso dell’ambiente per sostituire il primo a sigillare le microcamere. Chiamiamo il primo olio (ASAHIKLIN AE-3000 con 0,1 wt % SURFLON S-386) il “olio a filo” e il secondo olio (Fomblin Y25) l'”olio di sgelazione”, rispettivamente.

La strategia di sigillamento dell’olio in due fasi può realizzare una solida formazione dell’array di goccioline femtoliter in pochi minuti e senza strumentazione sofisticata. A causa del problema dell’evaporazione, è stato considerato difficile generare microreattori più piccoli dei volumi di picoliter28. FemDA ha affrontato questo problema ottimizzando sistematicamente i materiali e i processi utilizzati per la preparazione di microreattori/goccioline. Diverse caratteristiche degne di nota delle goccioline risultanti includono l’alta uniformità (o monodispersità), la stabilità e la biocompatibilità su scala femtolare. Il coefficiente di variazione (CV) del volume delle goccioline è solo del 3% (senza correzione della vignettatura per le immagini microscopiche), il più piccolo CV tra le piattaforme di goccioline al mondo, che garantisce una misurazione altamente parallela e quantitativa. La goccia di femtolitro è stabile per almeno 24 ore senza contaminazione incrociata tra le goccioline a temperatura ambiente, il che è prezioso per una misurazione affidabile del percorso temporale. Per quanto riguarda la biocompatibilità, siamo riusciti a sintetizzare varie proteine da un DNA modello a copia singola nella goccia femtolitro, che in precedenza era stata considerata difficile o inefficiente29,30. Sarebbe degno di chiarire perché alcune proteine in grado di essere sintetizzate nel FemDA non possono essere sintetizzate in altri sistemi di goccioline. FemDA non era solo un avanzamento tecnico, ma ha anche realizzato una misurazione quantitativa senza precedenti in grado di correlare la resa proteica (come riflesso dall’intensità di fluorescenza della gocciolina) al numero di molecole di DNA modello in ogni goccia. Di conseguenza, l’istogramma dell’intensità di fluorescenza delle goccioline dei CFPS con sede a FemDA ha mostrato una distribuzione discreta che può essere ben montata da una somma di distribuzioni gaussiane di intervalli picco-picco uguali. Inoltre, la probabilità di comparsa di goccioline contenenti diversi numeri di molecole di DNA era perfetta per una distribuzione di Poisson31. Così, la diversa resa proteica in ogni goccia può essere normalizzata in base alla distribuzione discreta. Questa caratteristica critica ci permette di separare le informazioni sull’attività ezimatica dall’intensità apparente, che non è ancora disponibile con altre piattaforme di microreattore. I sistemi di smistamento microfluidici esistenti per cellule microfluidiche sono abili nello smistamento completamente automatico e sono bravi a concentrare i campioni, ma a volte possono produrre solo un istogramma relativamente ampio o a coda lunga nell’aspetto analitico32,33. Il nostro sistema FemDA altamente quantitativo e biocompatibile stabilisce un nuovo punto di riferimento e un elevato standard analitico nel campo dello sviluppo di microreattori.

Gli oli e i surfactants che potrebbero essere utilizzati per la preparazione delle goccioline sono ancora molto limitati34. La combinazione di ASAHIKLIN AE-3000 e SURFLON S-386 stabilita a FemDA è un nuovo membro del crescente arsenale dell’interfaccia fisiochimica tra la fase acquosa e la fase dell’olio13. La nuova interfaccia in FemDA è fisicamente stabile, chimicamente inerte, e biologicamente compatibile con la trascrizione complessa, traduzione, e macchinare di modifica post-traduzione per molti tipi di proteine13. Sarebbe piuttosto interessante trovare una proteina che non può essere sintetizzata nelle impostazioni delle goccioline. Inoltre, il risparmio sui costi dei reagenti è più evidente nel sistema di gocciolina del femtolitro rispetto a quello dei sistemi di reattori nanoliter e picoliter35,36. In particolare, ci sarebbe spesso un grande volume morto, che è causato principalmente da tubi o forniture esterne, nei sistemi microfluidici di generazione di gocciolini, ma non nel nostro FemDA. Il formato della matrice è favorito anche dalla caratterizzazione microscopica ripetuta e dettagliata (simile alla cosiddetta analisi ad alto contenuto) per ogni singolo reattore37, piuttosto che una sola istantanea per un oggetto in rapido movimento. La scala femtobotera ha permesso l’integrazione di oltre un milione di reattori su un’area grande di un dito, mentre lo stesso numero di reattori nanollitri (se esiste) richiede un’area di metro quadrato, il che sarebbe indubbiamente poco pratico per la produzione o l’uso di tale sistema.

Protocol

1. Microfabbricazione del substrato di matrice a microcamera femtolare NOTA: condurre il seguente esperimento di microfabbricazione in una camera pulita. Indossare guanti e un abito da camera pulita prima di entrare nella camera pulita. Pulizia del substrato di vetro di copertura Impostare il vetro di copertura su una barra di rivestimento in vetro di copertura. Sonicare il vetro di copertura in idrossido di sodio 8 M (NaOH) per 15 min a temperatura ambiente (RT).AVVISO: …

Representative Results

Il processo di microfabbricazione consiste nella pulizia del substrato, nella funzionalizzazione della superficie, nel rivestimento CYTOP, nella fotolitografia, nell’incisione a secco, nella stripping fotoresista e nella pulizia finale. È importante sottolineare che il protocollo presentato ha permesso la rimozione completa del polimero civetta ciforo idrofobico all’interno delle microcamere Figura 3A), producendo una struttura idrofilo-in-idrofobico altamente parallela su un substrato di v…

Discussion

La misurazione altamente quantitativa basata sulle goccioline altamente uniformi, stabili e biocompatibili di FemDA ha permesso la distribuzione discreta, caratteristica unica del nostro studio diversa dalle altre. Abbiamo sistematicamente ottimizzato e dettagliato i processi di microfabbricazione e formazione delle goccioline in questo documento. Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo stabilito.

In primo luogo, il rivestimento uniforme del polimero CYTOP altamente viscoso sul substra…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal numero di sovvenzione JP18K14260 di JSPS KAKENHI e dal bilancio dell’Agenzia giapponese per la scienza e la tecnologia della Terra dei Animali. Ringraziamo Shigeru Deguchi (JAMSTEC) e Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) per aver fornito le strutture di caratterizzazione. Ringraziamo Ken Takai (JAMSTEC) per il supporto software commerciale. La microfabbricazione è stata condotta presso Takeda Sentanchi Supercleanroom, L’Università di Tokyo, sostenuta da “Nanotechnology Platform Program” del Ministero dell’Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia (MEXT), Giappone, Grant Number JPMXP09F19UT0087.

Materials

(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

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Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

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