Qui presentiamo un protocollo utilizzato per eseguire esperimenti di microscopia a forza di trazione su cellule B. Descriviamo la preparazione di gel morbidi in poliacrilammide e la loro funzionalizzazione, nonché l’acquisizione dei dati al microscopio e un riepilogo dell’analisi dei dati.
La microscopia a forza di trazione (TFM) consente la misurazione delle forze prodotte da una cellula su un substrato. Questa tecnica deduce le misurazioni della forza di trazione da un campo di spostamento osservato sperimentalmente prodotto da una cellula che tira su un substrato elastico. Qui, abbiamo adattato TFM per indagare la struttura spaziale e temporale del campo di forza esercitato dalle cellule B quando attivato dall’innesto dell’antigene del recettore cellulare B. La rigidità del gel, la densità delle perline e la funzionalizzazione delle proteine devono essere ottimizzate per lo studio di cellule relativamente piccole (~ 6 μm) che interagiscono con, e rispondono specificamente ai ligandi per i recettori della superficie cellulare.
Le cellule B sono le cellule produttrici di anticorpi del sistema immunitario. Per attivare la risposta immunitaria adattiva, acquisiscono prima l’antigene in una forma nativa (cioè non elaborata) attraverso uno specifico recettore chiamato recettore delle cellule B (BCR)1. Questo processo si verifica nella zona cellulare del linfonodo B. Anche se alcuni antigeni possono raggiungere la cellula B attraverso fluidi linfatici, la maggior parte degli antigeni, specialmente con un elevato peso molecolare (>70 kDa, che è la dimensione limite per i condotti linfatici) sono infatti presentati nella loro forma nativa sulla superficie di una cellula di presentazione dell’antigene (APC), tipicamente un macrofago del seno sottocapsulare o una cellula dendritica follicolare, attraverso la lectina o i recettori Fc (non specifici). Il contatto con questa cellula porta alla formazione di una sinapsi immunitaria in cui il BCR esercita forza sugli antigeni associati all’APC. L’associazione di un antigene al BCR avvia la segnalazione BCR, che può attivare meccanismi di generazione della forza. Queste forze potrebbero essere importanti per amplificare la segnalazione BCR, ma sono anche essenziali per le cellule B per estrarre e quindi internalizzare l’antigene.
Recenti studi hanno dimostrato che il BCR è effettivamente meccanosensibile2. Ad esempio, i substrati più rigidi suscitano una segnalazione BCR migliorata3. Inoltre, la forza generata alla sinapsi immunitaria tira su singoli BCR per sondare la sua affinità con l’antigene e quindi garantire la discriminazione di affinità4. È quindi interessante studiare la risposta meccanica delle cellule B alla presentazione dell’antigene e sezionare questa risposta in termini di tipo di recettori implicati (IgG/IgM)5, molecole di adesione (ligandi integrina) o in cellule farmacologicamente e geneticamente modificate (cioè silenziamento di una proteina a valle della segnalazione BCR o dinamica del citoscheletro)6.
Un metodo semplice per osservare la risposta di una cellula a un substrato di rigidità fisiologica e, allo stesso tempo, forze di studio esercitate sul substrato è la microscopia a forza di trazione (TFM). TFM consiste nell’osservare il campo di spostamento prodotto dalla cellula tirando su un substrato elastico. Originariamente la deformazione del gel è stata osservata attraverso le rughe dell’elastomero stesso mediante microscopia a contrasto di fase7, ma l’inserimento di microperline di fluorescenza come marcatori fiduciari ha permesso una migliore risoluzione e da allora è diventato lo standard8. Questo metodo è stato utilizzato per studiare la forza di trazione esercitata da cellule aderenti, tessuti e persino organoidi incorporati nei gel. Diverse varianti di TFM sono statesviluppate 9 tra cui, combinazione con microscopia a supersoluzione (cioè, STED10 o SRRF11),modifica dell’indice di rifrazione del gel per consentire la microscopia TIRF12,sostituzione delle perline con motivi nanostampati13e utilizzo di nanopillari al posto della superficie piatta14. Per una revisione completa di queste variazioni, vedere Colin-York etal.
Il protocollo qui presentato descrive una procedura per misurare le forze esercitate dalle cellule B su un substrato rivestito di antigene. Queste forze sono applicate sui ligandi (antigene) al fine di raggrupparli e successivamente estrarli dal substrato che presenta l’antigene. Abbiamo adattato il protocollo TFM standard per imitare la rigidità dei substrati fisiologici che presentano antigeni, le dimensioni e il rivestimento pertinente per le cellule B. Questo protocollo consente lo studio di più cellule contemporaneamente e può essere utilizzato in combinazione con tecniche di microscopia a fluorescenza e trattamenti chimici. Tuttavia, non mira a sondare le misurazioni della forza di una singola molecola, per le quali le pinzette ottiche16,le sonde ditensione molecolare 17,18,le sonde di forza biomembrana19e la microscopia a forza atomica20 sono tecniche più adatte. Rispetto ad altri metodi di misurazione della forza a singola cella (ad esempio, micropipette21 o micropiatte22)TFM consente la ricostruzione di una mappa completa delle forze esercitate alla sinapsi con una risoluzione di ~ 300 nm. Ciò è utile per identificare i modelli spazio-temporali nelle forze esercitate sulla superficie e, poiché il gel è compatibile con l’imaging confocale, per correlarli con il reclutamento di proteine specifiche (ad esempio, citoscheletro e proteine di segnalazione).
Sebbene TFM 3D sia possibile, non è compatibile con la rigidità e la configurazione che abbiamo utilizzato. Le deformazioni in 3D sono ottenibili da altre configurazioni più complesse come la microscopia a forza di protrusione (afm scansione di una membrana deformabile in cui le cellule sono placcate)23,24 e microscopia a sollecitazione di interferenza del risuonatore elastico (ERISM, un gel che funge da cavità di risinazione per la luce ed evidenziazione di deformazioni del substrato con precisione di pochi nanometri)25. Sebbene queste tecniche siano molto promettenti, non sono ancora state utilizzate nelle cellule B. Altri tipi di TFM, come sui nanopillari14, potrebbero essere usati per avere substrati più riproducibili. Tuttavia, questa geometria non è adattata alle cellule morbide poiché la cellula interpenetra i pilastri, il che complica l’analisi. Questo approccio è stato infatti utilizzato nelle cellule T per osservare la capacità della cellula di costruire strutture attorno ai pilastri26.
Nonostante la sua semplicità, TFM utilizzando gel di poliacrilammide consente l’osservazione simultanea di molte cellule e può essere implementato facilmente ed economicamente in qualsiasi laboratorio dotato di banco e un microscopio a epifluorescenza (anche se si consiglia un disco confocale / rotante).
Per imitare la rigidità fisiologica di un APC, abbiamo usato gel di poliacrilammide con una rigidità di ~ 500 Pa27 e funzionalizzato il gel con antigeni attivanti. In questo protocollo, abbiamo funzionalizzato la superficie del gel di poliacrilammide con lisozima all’uovo di gallina (HEL). Ciò consente la misurazione delle forze generate dalla stimolazione del BCR attraverso l’impegno del sito di legame dell’antigene. L’uso di questo antigene e delle cellule B specifiche hel dei topi MD4 garantisce una generazione di forza relativamente uniforme in risposta alla legatura dell’antigene28. Tuttavia, altre molecole (come l’anti-IgM per i topi B6) possono essere innesate sul gel, ma le forze generate in questi casi potrebbero essere più eterogenee e meno intense. Poiché le cellule B sono piccole celle (diametro ~6 μm), il numero di perline è stato ottimizzato per essere massimo ma ancora tracciabile. Per le celle di grandi dimensioni che esercitano forze ~kPa sui loro substrati, si possono ottenere risultati soddisfacenti usando perline relativamente sparse o eseguendo una semplice velocimetria dell’immagine delle particelle (PIV) per ricostruire il campo di deformazione. Tuttavia, per piccole cellule come i linfociti B che esercitano stress fino a ~50 Pa, è necessario l’uso del tracciamento di singole particelle (velocimetria di tracciamento delle particelle, PTV) per ottenere la precisione desiderata durante la ricostruzione del campo di deformazione. Per tracciare in modo affidabile le perline singolarmente, l’ingrandimento dell’obiettivo deve essere almeno 60x e la sua apertura numerica intorno a 1,3. Pertanto, i gel devono essere relativamente sottili (<50 μm), altrimenti le perline non sono visibili in quanto sono al di sopra della distanza di lavoro dell'obiettivo.
Il protocollo principale si compone di tre sezioni: preparazione del gel, funzionalizzazione del gel e imaging; altre due sezioni sono opzionali e sono dedicate alla quantificazione dell’estrazione dell’antigene e all’imaging delle cellule fluorescenti.
Il metodo TFM qui descritto consente lo studio sistematico delle capacità meccaniche attive delle cellule B. Nel contesto delle cellule B, questo è correlato alla capacità di estrarre e internalizzare l’antigene. Rispetto ad altri metodi TFM, il protocollo qui presentato è semplice e piuttosto riproducibile: la rigidità, misurata per indentazione di una microsfera di vetro e utilizzando il modello Hertz, è compresa tra 400 e 600 Pa. Protocolli simili sono stati utilizzati con successo non solo per le celle B35 ma anche per le celle T36. Rispetto ai nanopillari (usati anche per i linfociti T37) fornisce una superficie piatta omogenea, quindi i risultati sono più facili da interpretare poiché l’interazione del gel è principalmente vincolata ad essere tangenziale alla superficie.
Il protocollo che abbiamo descritto dà accesso alla dinamica spaziotemporale delle forze esercitate dalle cellule B su substrati che presentano antigeni. A livello spaziale questo fornisce informazioni sulla localizzazione delle forze, e in combinazione con la microscopia a fluorescenza, consente allo sperimentatore di correlare le forze locali con la presenza di molecole specifiche (cioè componenti del citoscheletro o della cascata di segnalazione BCR). A livello temporale, è possibile integrare quantità (come energia totale o sollecitazione totale) per fornire un valore per punto di tempo e ridurre il rumore. Ciò consente l’osservazione dell’evoluzione della forza di trazione nel tempo (crescita e plateau) e della presenza di modelli pulsatili.
Gli aspetti sperimentali critici per l’analisi sono descritti come segue. — densità cellulare: per eseguire un’analisi corretta, le cellule devono essere sufficientemente separate. Consideriamo una cellula aalizzabile se ha intorno ad essa una regione vuota delle sue dimensioni. — immagine di trasmissione: è consigliabile raccogliere almeno un’immagine di trasmissione delle cellule durante l’esperimento da utilizzare come maschera nell’analisi. (iii) Numero di perline nell’immagine: suggeriamo di analizzare solo le immagini in cui il numero di perline nella sinapsi è compreso tra 30 e 200 (cioè 1-8 perline/μm²). Densità più basse non consentono un’adeguata ricostruzione dello spostamento della mappa. Le alte densità di perline rendono inaffidabile il tracciamento di singole particelle. — il numero di perline deve essere costante durante l’esperimento; tuttavia, le fluttuazioni possono verificarsi a causa della piccola variabilità nelle condizioni di imaging (specialmente nelle perline troppo vicine l’una all’altra). La deriva di messa a fuoco, se si verifica, deve essere corretta e i fotogrammi problematici devono essere scartati. ( v) Qualità del gel: i gel con troppe crepe, la variabilità nella distribuzione delle perline o i gel troppo spessi devono essere scartati. (vi) A seconda del tipo di cella, dopo esposizioni ripetute, le cellule in ritardo (>300 fotogrammi) possono subire effetti fototossici. Si consiglia di eseguire il programma su una maschera priva di celle come “linea di base” da confrontare con i dati. Ciò fornisce una grandezza del livello di rumore esclusivamente a causa delle condizioni sperimentali.
I gel utilizzati per misurare la forza di trazione nell’adesione classica consentono lo studio dei processi che si verificano all’adesione focale (flussi di actina e reclutamento di molecole di segnalazione) – i punti in cui le forzevengono applicate 38,39. Tuttavia, le forze alla sinapsi non vengono applicate attraverso adesioni focali. Il modello spaziotemporale di generazione della forza presso la sinapsi immunitaria della cellula B non è stato studiato quantitativamente utilizzando questo metodo fino a poco tempo fa. Utilizzando TFM, abbiamo osservato per la prima volta, il patterning della forza alla sinapsi immunitaria della cellula B, come presentato nel nostro recentestudio 6,aprendo prospettive incoraggianti nello studio dei linfociti.
In particolare, questo metodo utilizza un’immagine scattata prima dell’arrivo delle cellule sul gel come immagine di riferimento per il calcolo della forza. I soliti protocolli TFM suggeriscono di prendere l’immagine di riferimento alla fine dell’esperimento, dopo aver staccato le cellule con tripina; questo permette allo sperimentatore di cercare una regione ricca di cellule. Sebbene ciò sia possibile anche qui, la tripsiderina è piuttosto inefficiente nel staccare le cellule B dal gel rivestito di antigene, è necessario attendere a lungo il distacco e il rischio di modifica e movimenti del gel (che rendono l’intero set di dati inspiegabile) è più alto.
Il metodo qui presentato è flessibile e può essere applicato per studiare l’effetto di altri segnali alla sinapsi immunitaria in quanto consente di innestare altre proteine sulla superficie del gel (ad esempio, sono stati testati ligandi integrina e immunoglobuline) e persino antigene fluorescente (vedi sezione 4). Inoltre, le cellule rimangono accessibili allo sperimentatore per il trattamento farmacologico e le perturbazioni locali. Infine, il metodo è anche compatibile con l’imaging di celle fisse. Per queste osservazioni, si consiglia di fare il gel su un coverslip, macchiare le cellule, incollare il coverslip su una diapositiva e solo allora aggiungere supporti di montaggio e un altro coverslip. L’osservazione verrà quindi eseguita con il gel in cima per evitare la degradazione dell’immagine attraverso il gel.
Possibili insidie sono la variabilità del gel nella polimerizzazione e nel rivestimento. I problemi di polimerizzazione sono dovuti principalmente alla qualità dell’iniziatore/catalizzatore. Inoltre, il gel può gonfiarsi, soprattutto se non utilizzato subito dopo il montaggio. Questo problema non sembra influenzare drammaticamente le proprietà meccaniche del gel, ma può rendere lo strato di perline irraggiungibile per l’obiettivo, rendendo efficacemente il gel inutile. Si consiglia di preparare gel extra per ogni condizione quando appare questo problema. Potrebbe esserci anche una certa variabilità nel rivestimento, ed è fondamentale avere sanpah Sulfo appena diluito.
In conclusione, abbiamo descritto un metodo semplice, economico e riproducibile per misurare le forze esercitate dalle cellule B alla sinapsi immunologica quando attivate dal ligando BCR. Può essere adattato per studiare la reazione ad altri ligandi e altri tipi di linfociti (cellule B di memoria, cellule T, ecc.) con l’uso del ligando del recettore corretto.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano M. Bolger-Munro per la lettura critica e riconoscono il Nikon Imaging Center@CNRS-InstitutCurie e PICT-IBiSA, Institut Curie, Parigi, membro dell’infrastruttura di ricerca nazionale France-BioImaging, per il supporto nell’acquisizione di immagini e nel Curie Animal Facility. PP è stato supportato dal CNRS. AK e JP sono stati supportati dalla borsa di dottorato Paris Descartes e dall’Ecole Doctorale FIRE- Programme Bettencourt. Questo progetto è stato finanziato con sovvenzioni a PP (ANR-10-JCJC-1504-Immuphy) e AMLD (ANR-PoLyBex-12-BSV3-0014-001, ERC-Strapacemi-GA 243103).
3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store aliquoted, protected from humidity |
40% Acrylamide Solution | Biorad | 1610140 | |
Alexa555 microscale protein labeling kit | Molecular Probes | A30007 | |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
B cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | |
B-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
2% Bis Solution | Biorad | 161-0142 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100-812-C | |
Coverslip 18mm | VWR | 631-1580 | |
Fetal calf serum | PAA | A15-151 | Decomplemented (40min @56°C) |
Fluorodishes FD35 | World Precision Instruments, Inc | FD35100 | |
Fluosphere: carboxylate-modified, 0.2um, dark red | Molecular Probes | F8807 | |
Hen Egg Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Stocked in aliquote 100mg/ml |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermofisher/Gibco | 11140035 | |
N,N,N',N'-tetrametiletilendiammine (TEMED) | Euromedex | 50406-B | |
PBS (Phosfate Buffer Saline) | Gibco | 10010-015 | |
Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-010 | |
RMPI 1640 – Glutamax I | Thermofisher | 61870-010 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 |