A مقايسة النور النور وتقييم السمية العصبية مع الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا العصبية العصبية العصبية البشرية
Summary
البروتوكول المقدم يصف طريقة لمجرة نوريت خارج و التقييم السمية العصبية من مركبات جزيء صغير.
Abstract
نيوريت مقايسة النمو وتقييم السمية العصبية هما دراستان رئيسيتان يمكن تنفيذها باستخدام الطريقة المعروضة هنا. يوفر هذا البروتوكول تحليلًا موثوقًا للمورفولوجيا العصبية مع قياسات كمية للتعديلات على طول نيوريت وتوطين البروتين المتشابك والوفرة عند العلاج بمركبات جزيء صغيرة. بالإضافة إلى تطبيق الطريقة المعروضة في دراسات النمو النوري، يمكن إجراء تقييم السمية العصبية لتقييم المركبات الكيميائية التجارية وتمييزها وترتيبها استنادًا إلى تأثيرها المحتمل على السمية العصبية التنموية.
على الرغم من أن خطوط الخلايا تستخدم في الوقت الحاضر على نطاق واسع في فحص مجمع في علم الأعصاب، فإنها غالبا ما تختلف وراثيا وphenotypically من أصل الأنسجة الخاصة بهم. الخلايا الأولية، من ناحية أخرى، الحفاظ على علامات هامة والوظائف التي لوحظت في الجسم الحي. ولذلك، نظرا لإمكانات الترجمة وأهمية الفسيولوجية التي يمكن أن تقدم هذه الخلايا neurite مقايسة النمو وتقييم السمية العصبية يمكن أن تستفيد إلى حد كبير من استخدام الخلايا البشرية السلف العصبي (hNPCs) كنموذج الخلية البشرية الأولية.
ويمكن استخدام الطريقة المعروضة هنا لفحص قدرة المركبات على الحث على النمو العصبي والعصبية من خلال الاستفادة من الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا العصبية العصبية البشرية، وهي نموذج خلية يمثل البيولوجيا البشرية بشكل وثيق”.
Introduction
نمو نيوريت هو عملية أساسية لتشكيل شبكة الخلايا العصبية وتجديد الأعصاب1,2. بعد الإصابة، النورية خارج يلعب دورا رئيسيا في تجديد الجهاز العصبي. النثر النوري هو أيضا عنصر مهم من الإشارات خارج الخلية في تحفيز الأنشطة التجدد العصبي لتعزيز نتائج الاضطرابات العصبية والإصابات العصبية3,4,5,6.
من خلال الحفاظ على إمكانات التمايز في إنتاج الأنساب العصبية المختلفة ، يمكن أن توفر الخلايا السلف العصبية البشرية (HNPCs) نظامًا نموذجيًا لدراسات وظائف الجهاز العصبي المركزي (CNS) والتنمية7و8و9. توفر الإمكانات الانتقالية العالية والأهمية الفسيولوجية لـ HNPCs كنموذج خلية بشرية أولية ميزة كبيرة في فحوصات اكتشاف الأدوية المرتبطة بالنوبات. ومع ذلك، يمكن أن يكون صيانة وتحجيم نماذج الخلايا الأولية لمجايسات عالية الإنتاجية تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة10،11،12،13.
بالإضافة إلى تطبيق الطريقة المقدمة في دراسات النمو النوري ، تقييم السمية العصبية هو تطبيق آخر باستخدام الخلايا العصبية المشتقة من HNPC. هناك الآلاف من المركبات الكيميائية التجارية التي إما لم يتم فحصها أو مع احتمال السمية العصبية غير مفهومة. ولذلك، فإن تجارب الفحص الأكثر موثوقية وفعالية لتقييم المركبات وتمييزها وترتيبها بناء على إمكاناتها في الحصول على السمية العصبية التنموية هي في ارتفاع الطلب14. إن زيادة انتشار الاضطرابات العصبية وحدوثها إلى جانب وفرة المركبات غير المختبرة في البيئة تستلزم إجراء تجارب أكثر جدارة بالثقة وكفاءة لتحديد المركبات البيئية الخطرة التي قد تشكل السمية العصبية15.
يمكن استخدام الطريقة المعروضة هنا للفحص لقدرة المركبات على تحفيز النمو العصبي والعصبية من خلال الاستفادة من الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا العصبية العصبية العصبية البشرية ، وهي نموذج خلية يمثل علم الأحياء البشري بشكل وثيق.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول هو واحد من عدد قليل من الأوراق المنشورة التي تصف اختبار طول نيوريت عند العلاج بمركبات الاختبار. وعلاوة على ذلك، فإننا نصف كيفية استخدام hNPCs لتقييم الخصية خارج نيوريت واعصاب. من خلال الاستفادة من هذا مقايسة النمو النوري وتقييم السمية العصبية على الخلايا العصبية المشتقة من hNP…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من خلال منحة البحوث NIMAD (940714) التي منحت لـ MAF.
Materials
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 – minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly‐L‐lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
References
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer’s disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer’s Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
