İnsan Nöral Progenitor Hücre Kaynaklı Nöronlar ile Bir Neurite Outgrowth Assa ve Nörotoksisite Değerlendirmesi
Summary
Sunulan protokol, küçük molekül bileşiklerinin nörat dışı büyüme testini ve nörotoksisite değerlendirmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.
Abstract
Neurite outgrowth tsay ve nörotoksisite değerlendirmesi burada sunulan yöntem kullanılarak yapılabilir iki önemli çalışmalardır. Bu protokol, nöronal morfolojinin, küçük molekül bileşikleri ile tedavi üzerine nötrit uzunluğu ve sinaptik protein lokalizasyonu ve bolluğu üzerine yapılan değişikliklerin nicel ölçümleri ile birlikte güvenilir bir analiz sağlar. Neurite outgrowth çalışmalarında sunulan yöntemin uygulanmasına ek olarak, potansiyel gelişimsel nörotoksisite etkisine göre ticari kimyasal bileşikleri değerlendirmek, ayırt etmek ve sıralamak için nörotoksisite değerlendirmesi yapılabilir.
Hücre hatları günümüzde yaygın olarak nörolojik bileşik tarama tahlillerinde kullanılan olsa da, genellikle genetik ve fenotipik doku kökenlerinden farklıdır. Birincil hücreler ise in vivo gözlenen önemli belirteçleri ve işlevleri korurlar. Bu nedenle, çeviri potansiyeli ve fizyolojik alaka nedeniyle bu hücrelerin neurite outgrowth çıkış ve nörotoksisite değerlendirmesi sunabilir önemli ölçüde birincil insan hücre modeli olarak insan nöral progenitor hücreleri (hNPCs) kullanarak yararlanabilir.
Burada sunulan yöntem, bileşiklerin insan nöral progenitor hücre kaynaklı nöronlardan yararlanarak nötrat büyümesini ve nörotoksisiteyi tetikleme yeteneğini taramak için kullanılabilir.”
Introduction
Neurite büyüme nöronal ağ ve sinir rejenerasyon oluşumu için temel bir süreçtir1,2. Bir yaralanma sonrasında, neurite outgrowth sinir sisteminin yenilenmesinde önemli bir rol oynar. Neurite outgrowth da nörodejeneratif,bozukluklar ve nöronal yaralanma3,4,5,6sonuçlarını artırmak için nöronal rejeneratif faaliyetleri indükleyen ekstrasellüler sinyal önemli bir unsurdur .
Çeşitli nöral soy üreten kendi farklılaşma potansiyelini koruyarak, insan nöral progenitor hücreleri (hNPCs) merkezi sinir sistemi çalışmaları için bir model sistemi sağlayabilir (CNS) fonksiyonu ve gelişimi7,8,9. HNP’lerin birincil insan hücresi modeli olarak yüksek çeviri potansiyeli ve fizyolojik önemi, neurite büyümeye bağlı ilaç keşif taramalarında önemli bir avantaj sağlamaktadır. Ancak, bakım ve yüksek iş gücü tahlilleri için birincil hücre modelleri ölçekleme zaman alıcı ve emek yoğunolabilir 10,11,12,13.
Neurite outgrowth çalışmalarında sunulan yöntemin uygulanmasına ek olarak, nörotoksisite değerlendirmesi hNPC kaynaklı nöronlar kullanılarak başka bir uygulamadır. Ya incelenmemiş ya da kötü anlaşılmış nörotoksisite potansiyeline sahip binlerce ticari kimyasal bileşik vardır. Bu nedenle, daha güvenilir ve etkili tarama deneyleri değerlendirmek için, ayırt etmek ve gelişimsel nörotoksisite ortaya potansiyeline dayalı bileşiklersıralamak için yüksek talep14. Ortamda denenmemiş bileşiklerin bolluğu ile birlikte nörolojik hastalıkların yaygınlık ve insidansı artış nörotoksisite 15 oluşturabilecek tehlikeli çevresel bileşikleri belirlemek için daha güvenilir ve verimli deneylergeliştirilmesini gerektirir15.
Burada sunulan yöntem, bileşiklerin insan nöral progenitor hücre kaynaklı nöronlardan yararlanarak nötrat büyümesini ve nörotoksisiteyi tetikleme yeteneğini taramak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, test bileşikleri ile tedavi üzerine neurite uzunluğu için test açıklayan birkaç yayınlanan makalelerden biridir. Ayrıca, bir neurite outgrowth tsay ve nörotoksisite değerlendirmesi için hNPCs nasıl kullanılacağını açıklar. HNCs kaynaklı nöronlar bu neurite outgrowth ve nörotoksisite değerlendirmesi kullanarak, epigenetik küçük molekül bileşikleri bir kategorinörojenik potansiyeli, HDAC inhibitörleri, neurite outgrowth indükleyen22gösterilmiştir . Ayrı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma MAF’ye verilen NIMAD araştırma hibesi (940714) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 – minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly‐L‐lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
References
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer’s disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer’s Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
