מורנה דיוק-גזור פרוסות הכבד כמודל Vivo Ex של ביולוגיה של הכבד
Summary
פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה לייצור פרוסות כבד בר קיימא לחתוך מפני עכברים. Vivo דגימות רקמות לשעבר יכול להישמר תחת רקמת המעבדה התנאים התרבות במשך ימים מרובים, מתן מודל גמיש לבחון פתוביולוגיה בכבד.
Abstract
הבנת המנגנונים של פגיעה בכבד, פיברוזיס בצהבת, ושחמת כי התחתון מחלות כבד כרונית (כלומר, נגיפי הפטיטיס, מחלת כבד שומני לא אלכוהוליים, מחלת כבד מטבולית, סרטן הכבד) דורש מניפולציה ניסויית של מודלים של בעלי חיים. ובתרבויות של תאי מבחנה שתי טכניקות יש מגבלות, כגון הדרישה של מספר גדול של בעלי חיים עבור מניפולציה vivo. עם זאת, בתרבויות מחוץ לגופית לא לשכפל את המבנה ואת התפקוד של הסביבה הכבד הרב-תאיים. השימוש של פרוסות הכבד בדיוק לחתוך היא טכניקה שבה פרוסות אחיד של כבד העכבר הקיימא נשמרים בתרבות רקמת המעבדה לטיפול ניסיוני. טכניקה זו ממלאת את הנישה הניסיונית הקיימת בין לימודי בעלי חיים ובשיטות תרבות של תאי מבחנה. הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה פשוטה ואמינה לבידוד והתרבות לחתוך בדיוק פרוסות הכבד מעכברים. כיישום של טכניקה זו, פרוסות vivo הכבד לשעבר מטופלים עם חומצות מרה כדי לדמות פציעה בכבד כולסטטי ובסופו של דבר להעריך את המנגנונים של פיברוגנזה הכבד.
Introduction
הפתוגנזה של רוב מחלות הכבד כרונית (כלומר, דלקת הכבד ויראלי, steatohepatitis שאינם אלכוהוליים, פגיעה בכבד כולסטטי וסרטן הכבד) כרוך אינטראקציות מורכבות בין סוגים שונים של תאי הכבד הכונן הדלקת, פיברוגנזה, סרטן התפתחות1,2. כדי להבין את המנגנונים המולקולריים הנמצאים בבסיס המחלות הכרוניות המבוססות על הכבד, יש לחקור את האינטראקציות בין סוגי תאי הכבד המרובים. בעוד קווי הכבד מרובים (ולאחרונה, אורגנואידים) יכול להיות תרבותי בתוך מבחנה, מודלים אלה לא לחקות במדויק את המבנה המורכב, פונקציה, ומגוון הסלולר של מיקרוסביבה הכבד3. יתרה מזאת, תאי כבד מתורבתים (בפרט, קווי תאים שעברו טרנספורמציה) עלולים לסטות מהביולוגיה המקורית של המקור. מודלים בעלי חיים משמשים ניסויים כדי לחקור את האינטראקציות בין סוגי תאי הכבד המרובים. עם זאת, הם עשויים להיות מופחתים באופן משמעותי בהיקף של מניפולציה ניסויית, בשל השפעות משמעותיות מחוץ ליעד באיברים הכבד ביותר (למשל, כאשר בדיקת therapeutics פוטנציאלי).
השימוש המדויק בפרוסות הכבד (pcls) בתרבות הרקמה היא טכניקה ניסיונית המשמשת לראשונה מטבוליזם של תרופות ומחקרים רעילות, והוא כולל את החיתוך של קיימא, בדיקת דק (סביב 100 לערך 250 יקרומטר עבה) הכבד פרוסות. זה מתיר את מניפולציה ניסיוני ישיר של רקמת הכבד לשעבר vivo4. הטכניקה מגשרת על פער ניסיוני בין מחקרי בעלי חיים vivo ובשיטות תרבות של תאי מבחנה, התגברות על החסרונות הרבים של שתי השיטות (כלומר, מגבלות מעשיות על מגוון הניסויים שניתן לבצע בחיות שלמות, כמו גם אובדן מבנה/תפקוד ומגוון הסלולר עם שיטות התרבות של תאי מבחנה).
יתר על כן, PCLS מגביר במידה רבה את הקיבולת הניסיונית בהשוואה למחקרים בעלי חיים שלמים. כמו עכבר אחד יכול לייצר יותר מ 48 פרוסות הכבד, זה גם מקל על השימוש הן בשליטה והן קבוצות טיפול מאותו כבד. בנוסף, הטכניקה מפרידה פיזית את רקמת הכבד ממערכות איברים אחרים; לכן, הוא מסיר תופעות פוטנציאליות מחוץ ליעד שיכולות להתרחש בחיות שלמות בעת בדיקת ההשפעות של גירוי אקסוגני.
בפרוטוקול זה, PCLS מופקים באמצעות הרטט עם להב רוטט. מחקרים אחרים השתמשו בהצלחה Krumdieck רקמת רקמה, כפי שמתואר Olinga ו שוסטר5. בתוך הרטט, רטט לרוחב של הלהב מונע קריעה של הרקמה האולטרה דקה הנגרמת על ידי מתח הטיה, כמו להב נדחף לתוך הרקמה. הן מבצעה הרטט ו Krumdieck רקמות לעבוד ביעילות ללא הטבעה מבנית של רקמת הכבד, אשר מייעל את הליך הפרוסות. טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ליצור PCLS מכבדים חולים, כולל אלה מדגמי העכבר פיברוזיס/שחמת6 ו steatosis הכבד7.
בנוסף להדגים את הטכניקות הדרושות לתרבות ההכנה והרקמה של pcls, דו ח זה גם בוחן את הכדאיות של רקמות אלה vivo ex על ידי מדידת אדנוזין טריפוספט (ATP) רמות בדיקת היסטולוגיה רקמות להעריך נמק פיברוזיס. כהליך ניסיוני מייצג, pcls מטופלים עם ריכוזי pathophysiological של שלוש חומצות מרה שונות (גליקולפילית, טאורוכופילית, חומצות כולית) כדי לדמות פציעה בכבד כולסטטי. בהקשר של פציעה בכבד כיס המרה, חומצה taurocholic בפרט הוכח להיות גדל באופן משמעותי הן סרום ומרה של ילדים עם סיסטיק פיברוזיס הקשורים בכבד המחלה8.
תאים מחולל הכבד גם טופלו בחלל החוץ עם חומצה taurocholic לדמות את רמות החומצה הגבוהות taurocholic נצפתה בחולים, טיפול זה גרם התפשטות מוגברת ובידול של תאים מחולל הכבד לקראת המרה (המרה) פנוטיפ9. לאחר מכן, PCLS טופלו לשעבר vivo עם רמות גבוהות של חומצה taurocholic, ומוגברת סמנים המרה הלוציט נצפו. זה תומך בהתבוננות מחוץ לגופית כי חומצה taurocholic מניע התפשטות המרה ו/או בידול בהקשר של רפואת ילדים סיסטיק פיברוזיס הקשורים מחלת כבד9.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול ממחיש את היישום של מורטין PCLS בידוד ותרבות רקמות, ואת ההליכים נועדו להעריך הן הכדאיות ואת כלי השירות, כמו גם לבחון את ההשפעות של מגשרים אקסוגני של הכבד ביולוגית באמצעות assays היסטולוגיה הביוכימי, ו qPCR. השירות הניסיוני של התרבות רקמות pcls במכרסמים ובבני אדם כבר הפגינו במגוון רחב של יי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענקי מחקר של המועצה הלאומית לחקר הבריאות והרפואה (NHMRC) של אוסטרליה (גרנט לא. APP1048740 ו-APP1142394 לG.A.R.; APP1160323 to J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). גרנט Ramm נתמך על ידי מלגת מחקר בכיר מ NHMRC של אוסטרליה (גרנט לא. APP1061332). מנואל פרננדז-רוחו נתמך על ידי התוכנית TALENTO של מדריד, ספרד (T1-BIO-1854).
Materials
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta – Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
