المورين الدقة قطع شرائح الكبد كنموذج السابق فيفو بيولوجيا الكبد
Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وموثوقة لإنتاج شرائح الكبد الدقيقة القابلة للتطبيق من الفئران. يمكن الحفاظ على عينات الأنسجة الجسمية السابقة في ظل ظروف زراعة الأنسجة المختبرية لعدة أيام ، مما يوفر نموذجًا مرنًا لفحص أمراض الباثوبيولوجيا الكبدية.
Abstract
فهم آليات إصابة الكبد، والتليف الكبدي، وتليف الكبد التي تكمن وراء أمراض الكبد المزمنة (أي التهاب الكبد الفيروسي، وأمراض الكبد الدهنية غير الكحولية، وأمراض الكبد الأيضية، وسرطان الكبد) يتطلب التلاعب التجريبي نماذج الحيوانات وثقافات الخلايا المختبرية. كلا الأسلوبين لها قيود ، مثل متطلبات أعداد كبيرة من الحيوانات للتلاعب في الجسم الحي. ومع ذلك، لا تستنسخ الخلايا المختبرية بنية ووظيفة البيئة الكبدية متعددة الخلايا. استخدام شرائح الكبد بدقة قطع هو تقنية التي يتم الحفاظ على شرائح موحدة من كبد الماوس قابلة للحياة في زراعة الأنسجة المختبرية للتلاعب التجريبي. تحتل هذه التقنية مكانة تجريبية موجودة بين الدراسات الحيوانية وأساليب زراعة الخلايا المختبرية. يصف البروتوكول المقدم طريقة مباشرة وموثوقة لعزل وزراعة شرائح الكبد الدقيقة من الفئران. وتطبيقا لهذه التقنية، يتم التعامل مع شرائح الكبد الجسم الحي السابق مع الأحماض الصفراوية لمحاكاة إصابة الكبد cholestatic وتقييم آليات الخلايا الليفية الكبدية في نهاية المطاف.
Introduction
الإمراض من أمراض الكبد المزمنة معظم (أي التهاب الكبد الفيروسي، والتهاب الكبد غير الكحولية، وإصابة الكبد cholestatic وسرطان الكبد) ينطوي على تفاعلات معقدة بين أنواع خلايا الكبد المختلفة المتعددة التي تدفع الالتهاب، والتولد الليفي، وتطور السرطان1،2. لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الأمراض المزمنة القائمة على الكبد، يجب التحقيق في التفاعلات بين أنواع خلايا الكبد المتعددة. في حين أن خطوط الخلايا الكبدية المتعددة (ومؤخرا، organoids) يمكن أن تكون مثقفة في المختبر، وهذه النماذج لا تحاكي بدقة بنية معقدة، وظيفة، والتنوع الخلوي للبيئة الدقيقة الكبدية3. وعلاوة على ذلك، فإن خلايا الكبد المستزرعة (على وجه الخصوص، خطوط الخلايا المتحولة) قد تنحرف عن بيولوجيا مصدرها الأصلي. وتستخدم نماذج الحيوانات تجريبيا للتحقيق في التفاعلات بين أنواع خلايا الكبد متعددة. ومع ذلك، قد تصبح منخفضة بشكل كبير في نطاق التلاعب التجريبي، وذلك بسبب آثار كبيرة خارج الهدف في الأعضاء خارج الكبد (على سبيل المثال، عند اختبار العلاجات المحتملة).
استخدام شرائح الكبد الدقيقة القطع (PCLS) في زراعة الأنسجة هو تقنية تجريبية استخدمت لأول مرة في دراسات استقلاب المخدرات وسميتها، وهي تنطوي على قطع شرائح الكبد القابلة للحياة وفائقة النحافة (حوالي 100-250 ميكرومتر) . هذا يسمح التلاعب التجريبي المباشر من أنسجة الكبد السابقين الجسم الحي4. هذه التقنية الجسور الفجوة التجريبية بين في الدراسات الحيوانية في الجسم الحي وطرق زراعة الخلايا في المختبر ، والتغلب على العديد من العيوب من كلا الطريقتين (أي ، حدود عملية على مجموعة من التجارب التي يمكن القيام بها في الحيوانات كلها ، فضلا عن فقدان الهيكل / وظيفة والتنوع الخلوي مع أساليب زراعة الخلية المختبرية).
وعلاوة على ذلك، يزيد PCLS بشكل كبير من القدرة التجريبية مقارنة بالدراسات الحيوانية الكاملة. كما يمكن أن تنتج ماوس واحد أكثر من 48 شرائح الكبد، وهذا يسهل أيضا استخدام كل من مجموعات التحكم والعلاج من نفس الكبد. بالإضافة إلى ذلك ، تفصل هذه التقنية فعليًا أنسجة الكبد عن أنظمة الأعضاء الأخرى . لذلك ، فإنه يزيل الآثار المحتملة خارج الهدف التي يمكن أن تحدث في الحيوانات بأكملها عند اختبار آثار المحفزات الخارجية.
في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء PCLS باستخدام هزاز مع شفرة تهتز بشكل طولاني. وقد استخدمت دراسات أخرى بنجاح تقطيع الأنسجة Krumdieck، كما هو موضح في أولينغا وشوبان5. في الهزاز ، يمنع الاهتزاز الجانبي للشفرة تمزق الأنسجة فائقة النحافة الناجمة عن إجهاد القص ، حيث يتم دفع النصل إلى الأنسجة. يعمل كل من الهزاز وتقطيع الأنسجة Krumdieck بشكل فعال دون التضمين الهيكلي لأنسجة الكبد ، مما يبسط إجراء التقطيع. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لإنشاء PCLS من الكبد المريضة، بما في ذلك تلك من نماذج الماوس من التليف / تليف الكبد6 والتهاب الكبد7.
بالإضافة إلى إظهار التقنيات اللازمة لإعداد وزراعة الأنسجة من PCLS، وهذا التقرير يدرس أيضا صلاحية هذه الأنسجة الجسم الحي السابقين عن طريق قياس مستويات أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) وفحص أنسجة الأنسجة لتقييم نخر والتليف. كإجراء تجريبي تمثيلي ، يتم التعامل مع PCLS بتركيزات فيزيولوجية ثلاثية من ثلاثة أحماض صفراء مختلفة (glycocholic ، taurocholic ، والأحماض التشوليك) لمحاكاة إصابة الكبد الالمرارة. في سياق إصابة الكبد التشوستاتيكي ، ثبت أن حمض الطوروكوليك على وجه الخصوص قد زاد بشكل كبير في كل من المصل والصفراء للأطفال الذين يعانون من التليف الكيسي المرتبط بمرض الكبد8.
كما تم علاج خلايا ذرية الكبد في المختبر مع حمض التاوروشوليك لمحاكاة مستويات حمض التاوروشوليك المرتفعة التي لوحظت في المرضى ، وتسبب هذا العلاج في زيادة انتشار وتمايز خلايا ذرية الكبد نحو نمط فينوتاي (cholangiocyte) الصفراري (cholangiocyte)9. وفي وقت لاحق، عولجت الـ PCLS بالجسم الحي السابق بمستويات مرتفعة من حمض الطوروكوليتش، ولوحظت علامات الكولينجيوسيتي المتزايدة. وهذا يدعم الملاحظة المختبرية أن حمض الطوروتشوليك يدفع الانتشار الصفراري و / أو التمايز في سياق مرض الكبد المرتبط بالتليف الكيسي للأطفال9.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوضح البروتوكول تطبيق عزل PCLS murine وزراعة الأنسجة ، وتم تصميم الإجراءات لتقييم كل من الجدوى والفائدة وكذلك دراسة آثار الوسطاء الخارجيين لعلم أمراض الباثوبيولوجيا الكبد باستخدام الاختبارات الكيميائية الحيوية ، وعلم الأنسجة ، وqPCR. وقد ثبت فائدة تجريبية من الأنسجة PCLS الاستزراع في القوارض وا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح بحثية من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا (المنحة رقم 100/2000). APP1048740 وAPP1142394 إلى G.A.R. APP1160323 إلى J.E.E.T. ، J.K.O. ، G.A.R.). يتم دعم Grant A. Ramm من قبل زمالة أبحاث كبار من NHMRC في أستراليا (المنحة رقم APP1061332). تم دعم مانويل فرنانديز روخو من قبل برنامج TALENTO في مدريد، إسبانيا (T1-BIO-1854).
Materials
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta – Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
