लिवर बायोलॉजी के एक पूर्व वीवो मॉडल के रूप में Murine परिशुद्धता-कट जिगर स्लाइस
Summary
यह प्रोटोकॉल चूहों से व्यवहार्य सटीक-कट जिगर के स्लाइस के उत्पादन के लिए एक सरल और विश्वसनीय विधि प्रदान करता है। पूर्व वीवो ऊतक नमूनों को प्रयोगशाला ऊतक संस्कृति की स्थिति के तहत कई दिनों तक बनाए रखा जा सकता है, जो जिगर रोगविज्ञान की जांच करने के लिए एक लचीला मॉडल प्रदान करता है।
Abstract
जिगर की चोट, हेपेटिक फाइब्रोसिस, और सिरोसिस के तंत्र को समझना जो क्रोनिक लिवर रोगों (यानी, वायरल हेपेटाइटिस, गैर-मादक फैटी यकृत रोग, मेटाबोलिक यकृत रोग, और यकृत कैंसर) को आबाद करने के लिए प्रयोगात्मक हेरफेर की आवश्यकता होती है पशु मॉडल और इन विट्रो सेल संस्कृतियों। दोनों तकनीकों की सीमाएं हैं, जैसे वीवो हेरफेर में बड़ी संख्या में जानवरों की आवश्यकता। हालांकि, इन विट्रो सेल संस्कृतियों संरचना और बहुकोशिकीय हेपेटिक पर्यावरण के कार्य को पुन: पेश नहीं करते हैं। सटीक-कट यकृत स्लाइस का उपयोग एक तकनीक है जिसमें व्यवहार्य माउस यकृत के समान स्लाइस प्रयोगात्मक हेरफेर के लिए प्रयोगशाला ऊतक संस्कृति में बनाए रखे जाते हैं। यह तकनीक एक प्रयोगात्मक आला है जो पशु अध्ययन और इन विट्रो सेल संस्कृति विधियों के बीच मौजूद है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल चूहों से अलग और संस्कृति सटीक-कट जिगर स्लाइस को अलग करने के लिए एक सीधी और विश्वसनीय विधि का वर्णन करता है। इस तकनीक के एक आवेदन के रूप में, पूर्व वीवो यकृत स्लाइस को कोलेस्टैटिक यकृत चोट का अनुकरण करने और अंततः हेपेटिक फाइब्रोजेनेसिस के तंत्र का आकलन करने के लिए पित्त एसिड के साथ इलाज किया जाता है।
Introduction
अधिकांश पुरानी यकृत रोगों (यानी, वायरल हेपेटाइटिस, नॉनअल्कोहलिक स्टीटोहेपेटाइटिस, कोलेस्टैटिक लिवर इंजरी और लिवर कैंसर) के रोगजनन में कई अलग-अलग यकृत कोशिका प्रकारों के बीच जटिल बातचीत शामिल है जो सूजन, फाइब्रोजेनेसिस और कैंसर विकास1,,2को ड्राइव करते हैं। इन पुरानी जिगर आधारित बीमारियों अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के लिए, कई जिगर सेल प्रकार के बीच बातचीत की जांच की जानी चाहिए । जबकि कई हेपेटिक सेल लाइनों (और हाल ही में, ऑर्गेनॉइड) को विट्रो में सुसंस्कृत किया जा सकता है, ये मॉडल हेपेटिक माइक्रोएनवायरमेंट3की जटिल संरचना, कार्य और सेलुलर विविधता का सटीक अनुकरण नहीं करते हैं। इसके अलावा, सुसंस्कृत जिगर की कोशिकाओं (विशेष रूप से, परिवर्तित सेल लाइनों) अपने मूल स्रोत जीव विज्ञान से विचलित हो सकता है । पशु मॉडल प्रयोगात्मक रूप से कई जिगर सेल प्रकार के बीच बातचीत की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, वे एक्सपेरिमेंटल अंगों में महत्वपूर्ण ऑफ-टारगेट प्रभावों के कारण प्रयोगात्मक हेरफेर की गुंजाइश में काफी कम हो सकते हैं (उदाहरण के लिए, संभावित चिकित्सा विज्ञान का परीक्षण करते समय)।
ऊतक संस्कृति में सटीक-कट यकृत स्लाइस (पीसीएलएस) का उपयोग एक प्रयोगात्मक तकनीक है जिसका उपयोग पहले दवा चयापचय और विषाक्तता अध्ययनों में किया जाता है, और इसमें व्यवहार्य, अल्ट्राथिन (लगभग 100−250 माइक्रोन मोटी) जिगर के स्लाइस की काटना शामिल है। यह जिगर के ऊतकों पूर्व वीवो4के प्रत्यक्ष प्रयोगात्मक हेरफेर की अनुमति देता है । तकनीक वीवो पशु अध्ययन और इन विट्रो सेल संस्कृति विधियों के बीच एक प्रयोगात्मक अंतर को पाटती है, दोनों तरीकों की कई कमियों पर काबू पाने (यानी, प्रयोगों की सीमा पर व्यावहारिक सीमाएं जो पूरे जानवरों में किया जा सकता है और साथ ही संरचना/कार्य और इन विट्रो सेल संस्कृति विधियों के साथ सेलुलर विविधता की हानि) ।
इसके अलावा, पीसीएलएस पूरे पशु अध्ययन की तुलना में प्रयोगात्मक क्षमता को काफी बढ़ाता है। जैसा कि एक माउस 48 से अधिक यकृत स्लाइस का उत्पादन कर सकता है, यह एक ही यकृत से नियंत्रण और उपचार समूहों दोनों के उपयोग की सुविधा भी प्रदान करता है। इसके अलावा, तकनीक शारीरिक रूप से अन्य अंग प्रणालियों से जिगर के ऊतकों को अलग करती है; इसलिए, यह संभावित ऑफ-टारगेट प्रभावों को हटा देता है जो एक्सोजेनस उत्तेजनाओं के प्रभावों का परीक्षण करते समय पूरे जानवरों में हो सकते हैं।
इस प्रोटोकॉल में, पीसीएलएस एक कंपन का उपयोग करके उत्पन्न होते हैं, जिसमें पार्श्व रूप से कंपन ब्लेड होता है। अन्य अध्ययनों ने सफलतापूर्वक एक Krumdieck ऊतक स्लाइसर का उपयोग किया है, जैसा कि ओलिंगा और श्प्पन5में वर्णित है। वाइब्रेटोम में, ब्लेड का पार्श्व कंपन कतरनी तनाव के कारण अल्ट्राथिन ऊतक को फाड़ने से रोकता है, क्योंकि ब्लेड को ऊतक में धकेल दिया जाता है। वाइब्रेटोम और क्रामडिक ऊतक स्लाइसर दोनों यकृत ऊतकों के संरचनात्मक एम्बेडिंग के बिना प्रभावी ढंग से काम करते हैं, जो टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया को सुव्यवस्थित करता है। इस तकनीक का उपयोग रोगग्रस्त यकृत से पीसीएलएस बनाने के लिए भी किया जा सकता है, जिसमें फाइब्रोसिस/सिरोसिस6 और हेपेटिक स्टीटोसिस7के माउस मॉडल शामिल हैं ।
पीसीएलएस की तैयारी और ऊतक संस्कृति के लिए आवश्यक तकनीकों का प्रदर्शन करने के अलावा, यह रिपोर्ट एडेनोसाइन त्रिपोस्फेट (एटीपी) के स्तर को मापने और नेक्रोसिस और फाइब्रोसिस का आकलन करने के लिए ऊतक हिटोलॉजी की जांच करके इन पूर्व वीवो ऊतकों की व्यवहार्यता की भी जांच करती है । एक प्रतिनिधि प्रयोगात्मक प्रक्रिया के रूप में, पीसीएलएस को कोलेस्टैटिक यकृत चोट का अनुकरण करने के लिए तीन अलग-अलग पित्त एसिड (ग्लाइकोकोलिक, तौरोचोलिक और चोलिक एसिड) की पैथोफिजियोलॉजिकल सांद्रता के साथ इलाज किया जाता है। कोलेस्टैटिक लिवर इंजरी के संदर्भ में, विशेष रूप से तौरोचोलिक एसिड को सिस्टिक फाइब्रोसिस से जुड़े जिगर की बीमारी8के साथ बच्चों के सीरम और पित्त दोनों में काफी वृद्धि दिखाई गई है ।
लिवर प्रोजेनिटर कोशिकाओं को रोगियों में देखे गए ऊंचा तारोचोलिक एसिड के स्तर का अनुकरण करने के लिए व्रोचोलिक एसिड के साथ विट्रो में भी इलाज किया गया है, और इस उपचार के कारण एक पित्त (कोलंगियोसाइट) फेनोटाइप9की ओर जिगर की जनक कोशिकाओं का प्रसार और भेदभाव बढ़ गया। बाद में, पीसीएलएस को पूर्व वीवो का इलाज किया गया, जिसमें टैरोचोलिक एसिड के ऊंचा स्तर था, और कोलैंगियोसाइट मार्कर में वृद्धि देखी गई। यह इन विट्रो ऑब्जर्वेशन का समर्थन करता है कि तारोचोलिक एसिड बाल चिकित्सा सिस्टिक फाइब्रोसिस से जुड़े जिगर की बीमारी9के संदर्भ में पित्त प्रसार और/या भेदभाव को चलाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल मूत्र पीसीएलएस अलगाव और ऊतक संस्कृति के आवेदन को दर्शाता है, और प्रक्रियाओं को व्यवहार्यता और उपयोगिता दोनों का आकलन करने के साथ-साथ जैव रासायनिक परख, हिटोलॉजी और क्यूपीसीआर का उपयोग करके ज?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को ऑस्ट्रेलिया के नेशनल हेल्थ एंड मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एनएचएमआरसी) (ग्रांट नंबर एक) से रिसर्च ग्रांट ्स ने सपोर्ट किया । APP1048740 और APP1142394 से G.A.R.; APP1160323 से J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.) । ग्रांट ए रैम को ऑस्ट्रेलिया के एनएचएमआरसी (ग्रांट नंबर एक) से एक सीनियर रिसर्च फेलोशिप द्वारा समर्थित किया जाता है । APP1061332) । मैनुएल फर्नांडीज-रोजो मैड्रिड, स्पेन (T1-BIO-1854) के टैलेंटो कार्यक्रम द्वारा समर्थित था।
Materials
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
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