肝臓生物学のEx Vivoモデルとしてのマウス精密カット肝臓スライス
Summary
このプロトコルは、マウスから実行可能な精密カット肝スライスを製造するための簡単で信頼性の高い方法を提供します。このエクスビボ組織サンプルは、ラボ組織培養条件下で複数回維持することができ、肝臓病理生物学を調べる柔軟なモデルを提供する。
Abstract
慢性肝疾患(ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患、代謝性肝疾患、肝臓がんなど)の根源となる肝障害、肝線維症、肝硬変のメカニズムを理解するには、実験的な操作が必要です。動物モデルとインビトロ細胞培養.両方の技術には、生体内操作のための多数の動物の要件などの制限があります。しかし、インビトロ細胞培養は多細胞性肝環境の構造や機能を再現しない。精密カット肝スライスの使用は、実験操作のために実験室組織培養で生き生きとしているマウス肝臓の均一なスライスを維持する技術である。この技術は、動物実験とインビトロ細胞培養法の間に存在する実験的ニッチを占めています。提示されたプロトコルは、マウスから精密カットされた肝臓スライスを分離し、培養するための簡単で信頼性の高い方法を記述しています。この技術の応用として、ex vivo肝スライスは胆汁酸で処理され、胆汁性肝損傷をシミュレートし、最終的には肝線維形成のメカニズムを評価する。
Introduction
ほとんどの慢性肝疾患の病因(すなわち、ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、胆管内肝障害および肝臓癌)は、炎症、線維形成、および癌の発症を促進する複数の異なる肝細胞タイプ間の複雑な相互作用を伴う1、2。2これらの慢性肝系疾患の根底にある分子メカニズムを理解するためには、複数の肝細胞タイプ間の相互作用を調べる必要があります。複数の肝細胞株(そして最近ではオルガノイド)はインビトロで培養することができるが、これらのモデルは肝微小環境3の複雑な構造、機能、および細胞多様性を正確にエミュレートしない。さらに、培養した肝細胞(特に形質転換細胞株)は、元の発生源生物学から逸脱する可能性がある。動物モデルは、複数の肝細胞タイプ間の相互作用を調べる実験に使用される。しかし、それらは、肝外器官(例えば、潜在的な治療薬をテストするとき)の有意なオフターゲット効果のために、実験的操作の範囲が有意に減少する可能性がある。
組織培養における精密カット肝スライス(PCLS)の使用は、薬物代謝および毒性研究で最初に使用される実験的技術であり、生き生きと超薄(厚さ約100〜250μm)の肝臓スライスの切断を含む。これは、肝臓組織ex vivo4の直接実験的操作を可能にする。この技術は、生体内動物実験とインビトロ細胞培養法との間の実験的なギャップを埋め、両方の方法の多くの欠点(すなわち、全動物で行うことができる実験の範囲の実用的な限界、ならびにインビトロ細胞培養法による構造/機能および細胞多様性の喪失)を克服する。
さらに、PCLSは、動物実験全体に比べて実験能力を大幅に増加させます。1つのマウスは48以上の肝臓スライスを産生することができるので、これはまた同じ肝臓からの対照群および処置群の両方の使用を促進する。さらに, この技術は、物理的に他の臓器系から肝臓組織を分離します;;したがって、外因性刺激の影響をテストする際に動物全体で起こり得る潜在的なオフターゲット効果を除去する。
このプロトコルでは、PCLSは横振動ブレードを備えたビブラートメを使用して生成されます。他の研究は、正常にクリンガとシュパン5に記載されているように、クルミエック組織スライサーを使用しています。ビブラートメでは、ブレードの横振動は、ブレードが組織に押し込まれるように、せん断応力によって引き起こされる超薄組織の引き裂きを防ぎます。ビブラートームとクルミエック組織スライサーの両方が肝臓組織の構造的な埋め込みなしで効果的に働き、スライス手順を合理化する。この技術はまた、疾患を有する肝臓からPCLSを作成するために使用することができる、 線維症/肝硬変6および肝性ステアトーシス7のマウスモデルからのものを含む。
PCLSの調製および組織培養に必要な技術を実証することに加えて、この報告書は、アデノシン三リン酸(ATP)レベルを測定し、壊死および線維症を評価するために組織組織組織を調べることによって、これらの生体組織の生存率を調べる。代表的な実験手順として、PCLSは、胆汁性肝損傷をシミュレートするために、3つの異なる胆汁酸(グリコリック、タウロコリック、および胆汁酸)の病態生理学的濃度で処理される。胆汁性肝障害の文脈において、特にタウロコリン酸は、嚢胞性線維症関連肝疾患8を有する小児の血清および胆汁の両方において有意に増加することが示されている。
肝臓前駆細胞は、患者において観察されたタウロチョル酸レベルの上昇をシミュレートするためにタウロチョル酸でインビトロで治療されており、この治療は胆管(胆管支面)表現型9に対する肝前駆細胞の増殖および分化の増加を引き起こした。続いて、PCLSは、タウロチョル酸の上昇したレベルでex vivoを処理し、コリンギオサイトマーカーの増加が観察された。これは、タウロチョル酸が小児嚢胞性線維症関連肝疾患の文脈における胆道増殖および/または分化を駆動するというインビトロ観察を支持する9。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、マウスPCLSの分離および組織培養の適用を実証し、この手順は、生化学的アッセイ、組織学、およびqPCRを使用して、肝病理生物学の外因性メディエーターの影響を評価するとともに、生存率と有用性の両方を評価するように設計されています。齧歯類およびヒトにおけるPCLS組織培養の実験的有用性は、microRNA 15 /RNA9/タンパク発現16、代?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、オーストラリアの国家保健医療研究評議会(NHMRC)からの研究助成金(グラントNo.)APP1048740およびAPP1142394からG.A.R.へ;APP1160323 から J.E.E.T.、J.K.O.、G.A.R.へ。グラント・A・ラムは、オーストラリアのNHMRC(グラントNo.)のシニア・リサーチ・フェローシップによってサポートされています。APP1061332)。マヌエル・フェルナンデス=ロホは、スペインのマドリード(T1-BIO-1854)のTALENTOプログラムによってサポートされました。
Materials
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
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