Karaciğer Biyolojisi Ex Vivo Modeli olarak Murine Precision-Cut Karaciğer Dilimleri
Summary
Bu protokol farelerden canlı hassas kesilmiş karaciğer dilimleri üretimi için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar. Ex vivo doku örnekleri laboratuvar doku kültürü koşullarında birden fazla gün boyunca muhafaza edilebilir, karaciğer patobiyolojisi incelemek için esnek bir model sağlayan.
Abstract
Kronik karaciğer hastalıklarının (viral hepatit, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı, metabolik karaciğer hastalığı ve karaciğer kanseri) altında yatan karaciğer hasarı, hepatik fibrozis ve siroz mekanizmalarının anlaşılması, hayvan modelleri ve in vitro hücre kültürleri. Her iki teknik de in vivo manipülasyon için hayvanların çok sayıda gereksinimi gibi sınırlamalar vardır. Ancak in vitro hücre kültürleri çok hücreli hepatik ortamın yapısını ve işlevini yeniden üretmez. Hassas kesilmiş karaciğer dilimlerinin kullanımı, deneysel manipülasyon için laboratuvar doku kültüründe tek tip fare karaciğeri dilimlerinin muhafaza edildiği bir tekniktir. Bu teknik, hayvan çalışmaları ve in vitro hücre kültürü yöntemleri arasında var olan deneysel bir niş kaplar. Sunulan protokol, farelerden hassas kesilmiş karaciğer dilimlerini izole etmek ve kültürü yapmak için basit ve güvenilir bir yöntemi tanımlar. Bu tekniğin bir uygulaması olarak, ex vivo karaciğer dilimleri kolestatik karaciğer hasarı simüle etmek ve sonuçta hepatik fibrogenez mekanizmaları değerlendirmek için safra asitleri ile tedavi edilir.
Introduction
En kronik karaciğer hastalıklarının patogenezi (yani, viral hepatit, nonalkolik steatohepatit, kolestatik karaciğer hasarı ve karaciğer kanseri) inflamasyon sürücü birden fazla farklı karaciğer hücre tipleri arasında karmaşık etkileşimler içerir, fibrogenezis, ve kanser gelişimi1,2. Bu kronik karaciğer bazlı hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için, birden fazla karaciğer hücre tipi arasındaki etkileşimler araştırılmalıdır. Birden fazla hepatik hücre hatları (ve daha yakın zamanda, organoidler) in vitro kültürlü olabilir iken, bu modeller doğru karmaşık yapısı, fonksiyonu taklit etmez, ve hepatik mikroçevre hücresel çeşitlilik3. Ayrıca, kültürlü karaciğer hücreleri (özellikle, dönüştürülmüş hücre hatları) orijinal kaynak biyolojisi sapma olabilir. Hayvan modelleri deneysel olarak birden fazla karaciğer hücre tipi arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılır. Ancak, ekstrahepatik organlardaki (örn. potansiyel terapötikleri test ederken) önemli ölçüde hedef dışı etkiler nedeniyle deneysel manipülasyon kapsamı önemli ölçüde azalabilir.
Doku kültüründe hassas kesim karaciğer dilimlerinin (PCLS) kullanımı ilk olarak ilaç metabolizması ve toksisite çalışmalarında kullanılan deneysel bir tekniktir ve uygulanabilir, ultra ince (yaklaşık 100−250 μm kalınlığında) karaciğer dilimlerinin kesilmesini içerir. Bu karaciğer dokusu ex vivo4doğrudan deneysel manipülasyon sağlar. Bu teknik, in vivo hayvan çalışmaları ile in vitro hücre kültürü yöntemleri arasında deneysel bir uçurum arasında köprü kurarak, her iki yöntemin de birçok dezavantajının üstesinden gelerek (örneğin, tüm hayvanlarda yapIlebilen deneylerin çeşitliliğinin pratik sınırları nın yanı sıra in vitro hücre kültürü yöntemleri ile yapı/fonksiyon ve hücresel çeşitlilik kaybı) arasında deneysel bir boşluk vardır.
Ayrıca, PCLS tüm hayvan çalışmaları ile karşılaştırıldığında büyük ölçüde deneysel kapasitesini artırır. Bir fare 48’den fazla karaciğer dilimleri üretebilir gibi, bu da aynı karaciğer hem kontrol ve tedavi gruplarının kullanımını kolaylaştırır. Buna ek olarak, teknik fiziksel olarak diğer organ sistemlerinden karaciğer dokusu ayırır; bu nedenle, eksojen uyaranların etkilerini test ederken tüm hayvanlarda oluşabilecek potansiyel hedef dışı etkileri ortadan kaldırır.
Bu protokolde, PCLS yanal titreşen bıçak ile bir vibratom kullanılarak oluşturulur. Diğer çalışmalar başarıyla olinga ve Schuppan5açıklandığı gibi, bir Krumdieck doku dilimleyici kullandık. Vibratomda, bıçağın yanal titreşimi, bıçak dokuya itilirken, kesme stresinin neden olduğu ultra ince dokunun yırtılmalarını önler. Hem vibratom hem de Krumdieck doku dilimleyicisi, dilimleme işlemini kolaylaştıran karaciğer dokusunun yapısal olarak gömülmeden etkin bir şekilde çalışır. Bu teknik aynı zamanda fibrozis / siroz6 ve hepatik steatoz7fare modelleri de dahil olmak üzere, hastalıklı karaciğerlerden PCLS oluşturmak için kullanılabilir.
Bu rapor, PCLS’nin hazırlanması ve doku kültürü için gerekli teknikleri göstermenin yanı sıra, adenozin trifosfat (ATP) düzeylerini ölçerek ve nekroz ve fibrozisi değerlendirmek için doku histolojisini inceleyerek bu ek sinol dokuların canlılığını da incelememektedir. Temsili bir deneysel prosedür olarak, PCLS kolestatik karaciğer hasarı simüle etmek için üç farklı safra asitleri (glikokolik, taurokolik ve kolik asitler) patofizyolojik konsantrasyonları ile tedavi edilir. Kolestatik karaciğer hasarı bağlamında, özellikle taurokolik asit kistik fibrozis ilişkili karaciğer hastalığı olan çocukların hem serum hem de safra önemli ölçüde artmış olduğu gösterilmiştir8.
Karaciğer progenitor hücreleri de hastalarda gözlenen yüksek taurokolik asit düzeylerini simüle etmek için taurokolik asit ile in vitro tedavi edilmiştir, ve bu tedavi bir biliyer doğru karaciğer progenitor hücrelerinin artan çoğalma ve farklılaşmasına neden oldu (kolanjiyosit) fenotip9. Daha sonra, PCLS taurokolik asit yüksek düzeyde ex vivo tedavi edildi, ve artmış kolanjiyosit belirteçleri gözlendi. Bu, taurokolik asit in vitro gözlem pediatrik kistik fibrozis ilişkili karaciğer hastalığı bağlamında safra proliferasyonu ve / veya farklılaşma sürücüler destekler9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol, murine PCLS izolasyon ve doku kültürünün uygulanmasını göstermektedir ve prosedürler hem canlılık hem de yarar değerlendirmek ve biyokimyasal tahliller, histoloji ve qPCR kullanarak karaciğer patobiyolojisi eksojen mediatörlerin etkilerini incelemek için tasarlanmıştır. Kemirgenlerde ve insanlarda PCLS doku kültürünün deneysel faydası, mikroRNA15/RNA9/protein ekspresyonu16, metabolizma17, viral …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) (Grant No) araştırma hibe tarafından desteklenmiştir. APP1048740 ve APP1142394 g.a.r. için; APP1160323 için J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm Avustralya NHMRC kıdemli araştırma bursu tarafından desteklenir (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo, Madrid, İspanya’nın TALENTO programı (T1-BIO-1854) tarafından desteklendi.
Materials
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta – Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
