הקרנה לפיטואסטרוגנים באמצעות קולטן אסטרוגן מבוסס תאים β הכתב Assay
Summary
יש לנו אופטימיזציה של קולטן אסטרוגן זמין מסחרית β הכתב assay עבור הקרנת מזונות פרימטים אנושיים ולא אנושיים לפעילות אסטרוגניים. אימתנו את ההסתעפות הזו בכך שהראינו שסויה ידועה של מזון אסטרוגניים רושמת גבוה, בעוד מזונות אחרים אינם מראים פעילות.
Abstract
צמחים הם מקור מזון לבעלי חיים רבים, והם יכולים לייצר אלפי כימיקלים. חלק מהתרכובות הללו משפיעות על תהליכים פיזיולוגיים בחולייתנים הצורכים אותם, כגון תפקוד אנדוקריני. Phytoestrogens, פיטוכימיקלים האנדוקרינית-פעילה הנחקרת ביותר, אינטראקציה ישירה עם ציר האשכים ההיפותלמו-יותרת המוח של המערכת האנדוקרינית החולייתנית. כאן אנו מציגים את השימוש החדשני של מבחנה מבוססת תאים כדי לסנן תמציות צמחים לנוכחות של תרכובות שיש להם פעילות ביולוגית אסטרוגניים. מבחנה זו משתמשת בתאי יונקים מהונדסים לבטא מאוד בטא קולטן אסטרוגן (ERβ) וכי כבר transfected עם גן לוציפראז. חשיפה לתרכובות עם פעילות אסטרוגניים גורמת לתאים לייצר אור. בדיקה זו היא דרך אמינה ופשוטה לבדוק פעילות אסטרוגניים ביולוגיים. יש לו מספר שיפורים על פני מבחנים חולפים חולפים, בעיקר, קלות השימוש, היציבות של התאים, ואת הרגישות של ההסתערות.
Introduction
צמחים הם מקור הכרחי של מזון עבור בעלי חיים רבים, מתן קלוריות וחומרים מזינים קריטיים להישרדות, רבייה, צמיחה, התפתחות, והתנהגות1. צמחים מייצרים אלפי כימיקלים, רבים כהתאמות לצמיחה שלהם, תחזוקה סטומטית, ורבייה. תרכובות אחרות, נחשב מטבוליטים משניים צמח (PSMs), יש פונקציות כי הם פחות ברורים, אם כי חלקם רעילים וסביר לשמש כהגנה מפני אוכלי עשב וטפילים (למשל, אלקלואידים, טאנינים)2,3. חלק מכימיקלים אלה יש את היכולת להשפיע על תהליכים פיזיולוגיים ארוכי טווח בבעלי חיים, כגון תפקוד אנדוקריני, אם כי מדוע אלה פיטוכימיקלים האנדוקרינית פעיל אינטראקציה עם המערכת האנדוקרינית החולייתנית עדיין לא ברור2,4.
Phytoestrogens, פיטוכימיקלים האנדוקרינית-פעילה הנחקרת ביותר, הם PSMs פוליפנוליים המחקים אסטרוגנים מבניים ופונקציונליים, המקיימים אינטראקציה ישירה עם ציר האשכים ההיפותלומו-יותרת המוח של המערכת האנדוקרינית החולייתנית5. בליעה של phytoestrogens בתזונת האדם קשורה להגנה מפני כמה סוגי סרטן, מחלות לב, תסמיני גיל המעבר, אם כי השפעות אחרות כוללות בעיות פוריות. למעשה, ההשפעות הפיזיולוגיות של תרכובות אלה התגלו בשנות הארבעים כאשר פוריות בכבשים יוחסה למרעה שלהם על תלתן עשיר בפיטואסטרוגן (Trifolium subterrareum)6. כאשר לבלוע, phytoestrogens יכול לעבור לתאים ולחקות את ההשפעות של אסטרוגן. בעוד phytoestrogens היו השפעות שליליות על פוריות הכבשים, הקשר בין phytoestrogens ופיזיולוגיה אינה פשוטה. כמו כבשים, קרנף לבן דרומי להפגין רגישות תרכובות אסטרוגניים במזון נגזר כמויות גבוהות של סויה אספסת. בנות של נקבות האכילו דיאטה זו במהלך ההריון נוטים פחות להתרבות7. עם זאת, מחקרים אחרים הראו כי phytoestrogens עשוי להיות השפעות חיוביות גם כן, כולל התבגרות של זקיקי השחלות בעכברים מבוגרים8, מניעת סרטן מסוימים, פעילות נוגדת חמצון, ואפקטים antiproliferative9.
רוחב ההשפעות של phytoestrogens אינם מפתיעים בהתחשב בכך אסטרוגנים להשפיע על מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות, כולל צמיחה, פיתוח, ויסות של מערכת הרבייה ומערכת העצבים המרכזית10. למרות שיש מנגנונים רבים של פעולה, phytoestrogens לעתים קרובות יש את היכולת לשנות, לשפר, או לשבש איתות אסטרוגן באמצעות היכולת שלהם לפעול כמו ליגנדים עבור קולטני אסטרוגן תוך גרעיני אלפא בטא (ERα ו ERβ). פיטואסטרוגנים רבים יש מבנה טבעת פנולי דומה אסטרוגנים המאפשר להם לקשור קולטני אסטרוגן. אלה עם פעילות אסטרוגניים אגוניסטי לתפקד כמו אסטרוגן, יצירת קומפלקס פעיל ER-ligand שיכול לעמעם ולקשור אלמנט תגובת אסטרוגן (ERE) ולהפעיל שעתוקגנים 11. לכן, אסטרוגנים ופיטואסטרוגנים לווסת את פעילות התא ואת תפקודי המערכת באמצעות מעשיהם כגורמי שעתוק.
כאן אנו מציגים את השימוש החדשני של מבחנה מבוססת תאים כדי לסנן תמציות צמחים לנוכחות של תרכובות שיש להם פעילות ביולוגית אסטרוגניים. אסאי זה משתמש בתאי CHO השחלות אוגר סיניים מהונדסים לבטא מאוד ERβ, אשר כבר חצו עם גחלילית(Photinus pyralis)גן לוציפראז מקושר מקדם ERE12. כאשר קיימים תרכובות אסטרוגניים, הם נקשרים למיון, מצטמצמים ונקשרים ל- ERE, מה שמוביל לתעתיק של גן לוציפראז. עם הוספת פתרון מצע, לוציפראז מזרז תגובה המובילה לפליטת פוטון. לכן, דגימות חיוביות לייצר דגימות אור ושליליות לא.
זה מבחנים זמינים מסחרית מבטל את הצורך במעבדות כדי transfect את תאי היונקים עם הגן הכתב קולטןאסטרוגן 13,14, אשר היה יציב ומשתנה ביעילות. ה- Assay מספק פלטפורמת transfection יציבה המאפשרת לקבוע במהירות ופשוט אם לצמח יש פעילות אסטרוגניים באמצעות כריכת קולטן.
אנו בודקים את ההשערה כי פולי סויה יש פעילות אסטרוגניים גבוהה יותר מאשר כל מזונות אחרים בהתחשב בריכוזים הידועים שלהם של איזופלבונים אסטרוגניים15 באמצעות מזונות אנושיים ממכולת מקומית.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדיקת כתב ERβ שפותחה כדי לסנן בנפרד סוכני תרופות מתאים גם לסינון מזונות צמחיים עבור phytoestrogens פעיל ביולוגית באמצעות ERβ. שיקולים חשובים בפרוטוקול כוללים טיפול בדגימות הצמח בזהירות: יש לייבש במהירות חומר צמחי טרי כדי למנוע דפוס או השפלה ביולוגית אחרת, ויש להרחיקו מהאור כדי למנוע פוטוליזה של ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לדייל לייטמן על אימון ראשוני בשימוש במבחני ארעי ארעיים כדי לקבוע פעילות אסטרוגניים של מזונות צמחיים פרימטים. תודה לברדפורד ווסטריץ’ ואריק ג’ונסון שעזרו להקים ציוד מעבדה ולהכשיר סטודנטים בשיטות חילוץ. לבסוף, תודה לאוניברסיטת אינדיאנה על מימון המחקר הזה.
Materials
| 1000 µL pipette | |||
| 20 µL pipette | |||
| 200 µL pipette | |||
| 37 ℃ water bath | |||
| 37 ℃, humidified 5% CO2 incubator | |||
| 70% ethanol | |||
| analytical balance | |||
| cell culture-rated laminar flow hood | |||
| dimethyl sulfoxide | |||
| disposable media basin, sterile | |||
| drip filtration system | |||
| Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
| HPLC grade methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit – analyzes 24 samples plus standard curve |
| lyophilizer | |||
| multi-channel pipette | |||
| orbital shaker | |||
| plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
| rotory evaporator | |||
| round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
| sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
| sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
| Whatman grade 1 paper | |||
| whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |
References
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
- Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution. International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).
- DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal. Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).
- Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -. L., Lambert, J. E., Rothman, J. M. . Primate Diet & Nutrition. , (2020).
- Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys. African Journal of Ecology. , (2019).
- Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).
- Tubbs, C. W., et al. Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility. General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).
- Shen, M., et al. Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model. European Journal of Medical Research. 22 (1), 42 (2017).
- Boué, S. M., et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Nishikawa, J. -. i., et al. New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).
- . . Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , (2020).
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda. American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).
- Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3′-diindolylmethane. Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).
- Whitten, P. L., Patisaul, H. B. Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action. Environmental Health Perspectives. 109, 5-20 (2001).
- Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. . Advances in Food and Nutrition Research. , (2019).
- Lutz, I., Kloas, W. Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding. Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).
- Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).
- Jeng, Y. -. J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells. Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).
- Dixon, R. A. Phytoestrogens. Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).
- Kuiper, G. G. J. M., et al. Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β. Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).
- Wasserman, M. D. . Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , (2011).
- Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure. Reproduction. 143 (3), 247-260 (2012).
