使用基于细胞的雌激素受体对植物雌激素进行筛查β记者分析

Summary

我们优化了一种市售雌激素受体β记者检测，用于筛查人类和非人类灵长类动物的食物，以进行雌激素活性活动。我们通过显示已知的雌激素人类食物大豆注册高，而其他食物显示没有活性来验证这一分析。

Abstract

植物是许多动物的食物来源，它们可以产生成千上万的化学物质。其中一些化合物影响消耗它们的脊椎动物的生理过程，如内分泌功能。植物雌激素，研究最充分的内分泌活性植物化学物质，直接与脊椎动物内分泌系统的下丘脑-皮质淋巴轴相互作用。在这里，我们介绍了一种新颖的利用基于细胞的检测方法来筛选植物提取物，以发现具有雌激素生物活性的化合物的存在。这种分析使用哺乳动物细胞设计，以高度表达雌激素受体β（ER+），并且已经与露西费酶基因转染。接触具有雌激素活性的化合物会导致细胞产生光。这种检测是测试生物雌激素活性的可靠和简单方法。它比瞬态透变检测有几种改进，最明显的是易于使用、细胞的稳定性和检测的灵敏度。

Introduction

植物是许多动物必需的食物来源，提供对生存、繁殖、生长、发育和行为至关重要的卡路里和营养物质^。植物产生成千上万的化学物质，许多是适应自身生长、植物维持和繁殖的。其他化合物，被视为植物二次代谢物（PSM），其功能不太清晰，虽然有些是有毒的，并可能用作防御食草动物和寄生虫（如生物碱，单宁^）2，3.其中一些化学物质有能力影响动物的长期生理过程，如内分泌功能，虽然为什么这些内分泌活性植物化学物质与脊椎动物内分泌系统相互作用仍不清楚^2，4。

植物雌激素，研究最充分的内分泌活性植物化学物质，是多酚类PSM，在结构和功能上模仿雌激素，直接与脊椎动物内分泌系统⁵的假体-垂体淋巴轴相互作用。在人类饮食中摄入植物雌激素与预防某些癌症、心脏病和更年期症状有关，尽管其他影响包括生育问题。事实上，这些化合物的生理影响是在20世纪40年代发现的，当时绵羊的不育归因于它们对富含植物雌激素的三叶草（三叶草）^的放牧。摄入后，植物雌激素可以进入细胞并模仿雌激素的作用。虽然植物雌激素对绵羊的生育能力有负面影响，但植物雌激素与生理学之间的关系并不简单。与绵羊一样，南方白犀牛对源自大量大豆和紫花花的饲料中的雌激素化合物表现出敏感性。在怀孕期间喂养这种饮食的女性的女儿不太可能繁殖^7。然而，其他研究表明，植物雌激素也可能有积极的影响，包括卵巢卵泡的成熟在老老鼠^8，预防某些癌症，抗氧化活性和抗增殖作用^9。

植物雌激素的影响范围并不奇怪，因为雌激素影响广泛的生物功能，包括生长，发育和调节生殖和中枢神经系统^10。虽然有许多作用机制，植物雌激素往往有能力修改，增强或破坏雌激素信号，通过他们的能力，作为配体的核内雌激素受体阿尔法和β（ER+和ER+）。许多植物雌激素具有类似于雌激素的酚环结构，允许它们结合雌激素受体。那些具有痛苦的雌激素活性功能，如雌激素，形成一个激活的ER-ligand复合物，可以变暗和结合雌激素反应元素（ERE），并触发基因转录^11。因此，雌激素和植物雌激素通过它们作为转录因子的行为来调节细胞活动和系统功能。

在这里，我们介绍了一种新颖的利用基于细胞的检测方法来筛选植物提取物，以发现具有雌激素生物活性的化合物的存在。这种检测使用中国仓鼠卵巢CHO细胞设计，以高度表达ER+，已被转染与萤火热病毒（Photinus皮拉里斯）荧光酶基因链接到ERE促进者^12。当雌激素化合物存在时，它们与急ER结合，变暗，并结合到ERE，导致荧光酶基因的转录。加入基板溶液后，卢西费酶催化导致光子发射的反应。因此，阳性样品产生的光和阴性样品不。

这种市售的检测无需实验室用报告基因和雌激素受体^13、14来传染哺乳动物细胞，这些受体的功效不稳定且变化无常。该检测提供了一个稳定的转染平台，能够快速而简单地通过受体结合确定植物是否具有雌激素活性。

我们测试了这样一个假设，即大豆的雌激素活性高于所有其他食物，因为大豆已知浓度为雌激素异黄酮^15， 使用来自当地杂货店的人类食物。

Protocol

1. 植物材料的准备 冷冻使用嗜酸剂新鲜收集的干燥植物物品。 为了保护样品免受光线照射，在干燥过程中用铝箔盖住腔室。 为了确保样品完全干燥，嗜酸，直到室不再感到寒冷触摸和植物材料不再失去质量时称重。 将干燥的植物存放在无菌低残留袋中，在没有光线的情况下，直到研磨。 使用带 0.85 mm 网格屏幕的研磨机精细研磨样品。 在没?…

Representative Results

在人类饮食中常见的22种水果和蔬菜提取物被筛选出雌激素化合物的存在。各种食物被检测，包括豆类，如大豆，雪豌豆和豌豆，因为豌豆家族是已知的植物雌激素16的来源，以及无花果，枣，玉米，胡萝卜，苹果，香蕉，草莓，番茄，甘蓝和卷心菜。内分泌破坏化合物存在于常见物质（例如塑料和杀虫剂）中，有些通过红外体17具有生物活性。如果可能，对有?…

Discussion

ER+记者检测开发为单独筛选药物制剂也适用于筛选植物性植物雌激素通过 ER+生物活性的食物。协议中的重要考虑因素包括小心处理植物样品：需要迅速干燥新鲜植物材料以防止成型或其他生物退化，并且需要远离光线以防止化合物¹⁸的光解。制造商提供的检测协议¹² 是明确的，需要很少的修改进行筛选。制造商建议的标准曲线已在此协议中进行了修改，以增加?…

Materials

1000 µL pipette
20 µL pipette
200 µL pipette
37 ℃ water bath
37 ℃, humidified 5% CO2 incubator
70% ethanol
analytical balance
cell culture-rated laminar flow hood
dimethyl sulfoxide
disposable media basin, sterile
drip filtration system
Erlenmeyer flasks			125 mL and 250 mL
HPLC grade methanol
Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays	Indigo Biosciences	IB00411	Assay kit – analyzes 24 samples plus standard curve
lyophilizer
multi-channel pipette
orbital shaker
plate-reading luminometer			ex. Bioteck Synergy HTX
rotory evaporator
round bottom flasks			50 mL and 300 mL
sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins
sterile tips			200 µL and 1000 µL
Whatman grade 1 paper
whirl-pak bags			sterile polyethylene bags