Screening for fytoøstrogener ved hjælp af en cellebaseret østrogenreceptor β Reporter Assay

Summary

Vi har optimeret en kommercielt tilgængelig østrogen receptor β reporter analyse for screening menneskelige og ikke-menneskelige primat fødevarer til østrogen aktivitet. Vi validerede denne analyse ved at vise, at den kendte østrogene menneskelige fødevarer soja registre høj, mens andre fødevarer viser ingen aktivitet.

Abstract

Planter er en fødekilde for mange dyr, og de kan producere tusindvis af kemikalier. Nogle af disse forbindelser påvirker fysiologiske processer i hvirveldyrene, der forbruger dem, såsom endokrine funktion. Phytoøstrogener, de mest velundersøgte endokrine-aktive fytokemikalier, interagerer direkte med den hypothalamo-hypofyse gonadal akse i hvirveldyr endokrine system. Her præsenterer vi den nye brug af en cellebaseret analyse til at screene planteekstrakter for tilstedeværelsen af forbindelser, der har østrogen biologisk aktivitet. Denne analyse bruger pattedyrsceller, der er konstrueret til at udtrykke østrogenreceptor beta (ERβ), og som er blevet transfected med et luciferase gen. Eksponering for forbindelser med østrogen aktivitet resulterer i, at cellerne producerer lys. Denne analyse er en pålidelig og enkel måde at teste for biologisk østrogen aktivitet. Det har flere forbedringer i forhold til forbigående transfekt assays, især brugervenlighed, stabiliteten af cellerne, og følsomheden af analysen.

Introduction

Planter er en nødvendig fødekilde for mange dyr, der giver kalorier og næringsstoffer, der er kritiske for overlevelse, reproduktion, vækst, udvikling og adfærd¹. Planter producerer tusindvis af kemikalier, mange som tilpasninger til deres egen vækst, stomatisk vedligeholdelse og reproduktion. Andre forbindelser, anses plante sekundære metabolitter (PSMs), har funktioner, der er mindre klare, selv om nogle er giftige og sandsynligvis anvendes som et forsvar mod planteædende og parasitisme (f.eks alkaloider, tanniner)^2,3. Nogle af disse kemikalier har evnen til at påvirke langsigtede fysiologiske processer hos dyr, såsom endokrine funktion, selv om hvorfor disse endokrine-aktive fytokemikalier interagerer med hvirveldyr endokrine system er stadig uklart^2,4.

Fytoøstrogener, de mest velundersøgte endokrine-aktive fytokemikalier, er polyphenoliske PSM’er, der strukturelt og funktionelt efterligner østrogener, der direkte interagerer med hypothalomo-hypofyse-gonadal aksen i hvirveldyrets endokrine system⁵. Indtagelse af fytoøstrogener i den menneskelige kost er forbundet med beskyttelse mod nogle kræftformer, hjertesygdomme, og overgangsalderen symptomer, selv om andre virkninger omfatter fertilitetsproblemer. Faktisk blev de fysiologiske virkninger af disse forbindelser opdaget i 1940’erne, da infertilitet hos får blev tilskrevet deres græsning på fytoøstrogen-rige kløver (Trifolium subterrareum)⁶. Når de indtages, kan fytoøstrogener passere ind i cellerne og efterligne virkningerne af østrogen. Mens fytoøstrogener havde negative virkninger på fårefertiliteten, er forholdet mellem fytoøstrogener og fysiologi ikke enkelt. Ligesom får udviser sydlige hvide næsehorn følsomhed over for østrogenforbindelser i foder, der stammer fra store mængder soja og lucerne. Døtre af kvinder fodret denne kost under graviditeten er mindre tilbøjelige til at reproducere⁷. Andre undersøgelser har imidlertid vist, at fytoøstrogener også kan have positive virkninger, herunder modning af æggestokkenes follikler hos ældre mus⁸, forebyggelse af visse kræftformer, antioxidantaktivitet og antiproliferative virkninger⁹.

Bredden af virkninger af fytoøstrogener er ikke overraskende, da østrogener påvirker en bred vifte af biologiske funktioner, herunder vækst, udvikling og regulering af reproduktions- og centralnervesystemet¹⁰. Selv om der er mange virkningsmekanismer, phytoestrogens ofte har evnen til at ændre, forbedre eller forstyrre østrogen signalering gennem deres evne til at fungere som ligands for intranukleare østrogen receptorer alfa og beta (ERα og ERβ). Mange fytoøstrogener har en phenol ring struktur svarende til østrogener, der giver dem mulighed for at binde østrogen receptorer. Dem med agonistisk østrogen aktivitet fungerer som østrogen, danner en aktiveret ER-ligand kompleks, der kan dæmpe og binde sig til en østrogen respons element (ERE) og udløse gen transskription¹¹. Således regulerer østrogener og fytoøstrogener celleaktivitet og systemfunktioner gennem deres handlinger som transskriberingsfaktorer.

Her præsenterer vi den nye brug af en cellebaseret analyse til at screene planteekstrakter for tilstedeværelsen af forbindelser, der har østrogen biologisk aktivitet. Denne analyse bruger kinesiske hamster æggestokke CHO celler manipuleret til meget udtrykke ERβ, som er blevet transfected med firefly (Photinus pyralis) luciferase gen knyttet til en ERE promotor¹². Når østrogene forbindelser er til stede, binder de sig til ER, dimerize og binder sig til ERE, hvilket fører til transskription af luciferase-genet. Ved tilsætning af en substratopløsning katalyserer luciferase en reaktion, der fører til fotonemission. Derfor producerer positive prøver lys, og negative prøver producerer ikke.

Denne kommercielt tilgængelige analyse eliminerer behovet for laboratorier til at transfektere pattedyrcellerne med reportergenet og østrogenreceptoren^13,14, som var ustabil og variabel i effekt. Analysen giver en stabil transfektplatform, der giver mulighed for hurtigt og enkelt at afgøre, om en plante har østrogen aktivitet via receptorbinding.

Vi tester hypotesen om, at sojabønner har højere østrogen aktivitet end alle andre fødevarer i betragtning af deres kendte koncentrationer af østrogen isoflavoner¹⁵ ved hjælp af menneskelige fødevarer fra lokale købmænd.

Protocol

1. Tilberedning af plantematerialer Frys tørre planteelementer, der blev indsamlet frisk ved hjælp af en lyophilizer. For at beskytte prøver mod lys skal du dække kamre med aluminiumsfolie under tørringsprocessen. For at sikre, at prøverne er helt tørre, lyophilize indtil kamre ikke længere føler koldt at røre ved og plantematerialer ikke længere mister masse, når vejes. Opbevar tørrede planter i sterile poser med lavt restprodukt i mangel af lys indtil slibning. …

Representative Results

22 ekstrakter af frugt og grøntsager, der almindeligvis findes i menneskelig kost, blev screenet for tilstedeværelsen af østrogenforbindelser. En række fødevarer blev analyseret, herunder bælgfrugter, såsom sojabønner, sne ærter, og snap ærter, som ærten familien er en kendt kilde til fytoøstrogener16, samt figner, datoer, majs, gulerødder, æbler, bananer, jordbær, tomat, grønkål og kål. Hormonforstyrrende forbindelser findes i almindelige stoffer (f.eks. plast og pesticider), og…

Discussion

ERβ reporter assay udviklet til individuelt screene farmaceutiske agenser er også egnet til screening plantefødevarer for fytoøstrogener biologisk aktive gennem ERβ. Vigtige overvejelser i protokollen omfatter behandling af planteprøverne med omhu: Frisk plantemateriale skal tørres hurtigt for at forhindre støbning eller anden biologisk nedbrydning, og det skal holdes væk fra lys for at forhindre fotolyse af forbindelserne¹⁸. Analysen protokol¹² fra producenten er …

Materials

1000 µL pipette
20 µL pipette
200 µL pipette
37 ℃ water bath
37 ℃, humidified 5% CO2 incubator
70% ethanol
analytical balance
cell culture-rated laminar flow hood
dimethyl sulfoxide
disposable media basin, sterile
drip filtration system
Erlenmeyer flasks			125 mL and 250 mL
HPLC grade methanol
Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays	Indigo Biosciences	IB00411	Assay kit – analyzes 24 samples plus standard curve
lyophilizer
multi-channel pipette
orbital shaker
plate-reading luminometer			ex. Bioteck Synergy HTX
rotory evaporator
round bottom flasks			50 mL and 300 mL
sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins
sterile tips			200 µL and 1000 µL
Whatman grade 1 paper
whirl-pak bags			sterile polyethylene bags