Screening op fyto-oestrogenen met behulp van een celgebaseerde oestrogeenreceptor β Reporter Assay
Summary
We hebben geoptimaliseerd een commercieel beschikbare oestrogeen receptor β reporter test voor het screenen van menselijk en niet-menselijk primaat voedsel voor oestrogene activiteit. We valideerden deze test door aan te tonen dat de bekende oestrogene soja voor menselijke voeding hoog registreert, terwijl andere voedingsmiddelen geen activiteit vertonen.
Abstract
Planten zijn een bron van voedsel voor veel dieren en ze kunnen duizenden chemicaliën produceren. Sommige van deze verbindingen beïnvloeden fysiologische processen in de gewervelde dieren die ze consumeren, zoals endocriene functie. Fyto-oestrogenen, de meest bestudeerde endocriene actieve fytochemicaliën, interageren direct met de hypothalamo-hypofyse gonadale as van het gewervelde endocriene systeem. Hier presenteren we het nieuwe gebruik van een celgebaseerde test om plantenextracten te screenen op de aanwezigheid van verbindingen die oestrogene biologische activiteit hebben. Deze test maakt gebruik van zoogdiercellen die zijn ontworpen om oestrogeenreceptor bèta (ERβ) sterk uit te drukken en die zijn getransfecteerd met een luciferase-gen. Blootstelling aan verbindingen met oestrogene activiteit resulteert in de cellen die licht produceren. Deze test is een betrouwbare en eenvoudige manier om te testen op biologische oestrogene activiteit. Het heeft verschillende verbeteringen ten opzichte van voorbijgaande transfectietests, met name het gebruiksgemak, de stabiliteit van de cellen en de gevoeligheid van de test.
Introduction
Planten zijn een noodzakelijke bron van voedsel voor veel dieren en leveren calorieën en voedingsstoffen die van cruciaal belang zijn voor overleving, voortplanting, groei, ontwikkeling en gedrag1. Planten produceren duizenden chemicaliën, veel als aanpassingen voor hun eigen groei, stomatisch onderhoud en reproductie. Andere verbindingen, beschouwd als secundaire metabolieten (PSM’s) van planten, hebben functies die minder duidelijk zijn, hoewel sommige giftig zijn en waarschijnlijk worden gebruikt als verdediging tegen herbivoren en parasitisme (bijv. alkaloïden, tannines)2,3. Sommige van deze chemische stoffen hebben het vermogen om fysiologische processen op lange termijn bij dieren te beïnvloeden, zoals endocriene werking, hoewel waarom deze endocriene actieve fytochemicaliën interageren met het gewervelde endocriene systeem nog steeds onduidelijk is2,4.
Fyto-oestrogenen, de meest bestudeerde endocriene actieve fytochemicaliën, zijn polyfenolische PSM’s die structureel en functioneel oestrogenen nabootsen, direct interagerend met de hypothalomo-hypofyse gonadale as van het gewervelde endocriene systeem5. Inname van fyto-oestrogenen in het menselijke dieet wordt geassocieerd met bescherming tegen sommige kankers, hartaandoeningen en menopauzesymptomen, hoewel andere effecten vruchtbaarheidsproblemen omvatten. In feite werden de fysiologische effecten van deze verbindingen ontdekt in de jaren 1940 toen onvruchtbaarheid bij schapen werd toegeschreven aan hun begrazing op fyto-oestrogeenrijke klaver (Trifolium subterrareum)6. Bij inname kunnen fyto-oestrogenen in cellen overgaan en de effecten van oestrogeen nabootsen. Hoewel fyto-oestrogenen negatieve effecten hadden op de vruchtbaarheid van schapen, is de relatie tussen fyto-oestrogenen en fysiologie niet eenvoudig. Net als schapen vertonen zuidelijke witte neushoorns gevoeligheid voor oestrogene verbindingen in voer afkomstig van grote hoeveelheden soja en luzerne. Dochters van vrouwen die dit dieet tijdens de zwangerschap krijgen, hebben minder kans om zich voort te planten7. Andere studies hebben echter aangetoond dat fyto-oestrogenen ook positieve effecten kunnen hebben, waaronder rijping van eierstokfollikels bij oudere muizen8, preventie van bepaalde kankers, antioxiderende activiteit en antiproliferatieve effecten9.
De breedte van de effecten van fyto-oestrogenen is niet verrassend, aangezien oestrogenen een breed scala aan biologische functies beïnvloeden, waaronder groei, ontwikkeling en regulering van het voortplantings- en centrale zenuwstelsel10. Hoewel er veel werkingsmechanismen zijn, hebben fyto-oestrogenen vaak het vermogen om oestrogeensignalering te wijzigen, te verbeteren of te verstoren door hun vermogen om te fungeren als liganden voor de intranucleaire oestrogeenreceptoren alfa en bèta (ERα en ERβ). Veel fyto-oestrogenen hebben een fenolische ringstructuur vergelijkbaar met oestrogenen waarmee ze oestrogeenreceptoren kunnen binden. Degenen met agonistische oestrogene activiteit functioneren zoals oestrogeen en vormen een geactiveerd ER-ligandcomplex dat kan dimmen en binden aan een oestrogeenresponselement (ERE) en gentranscriptie kan activeren11. Zo reguleren oestrogenen en fyto-oestrogenen celactiviteit en systeemfuncties door hun acties als transcriptiefactoren.
Hier presenteren we het nieuwe gebruik van een celgebaseerde test om plantenextracten te screenen op de aanwezigheid van verbindingen die oestrogene biologische activiteit hebben. Deze test maakt gebruik van Chinese hamster eierstok CHO cellen ontworpen om zeer express ERβ, die zijn getransfecteerd met de vuurvlieg (Photinus pyralis) luciferase gen gekoppeld aan een ERE promotor12. Wanneer oestrogene verbindingen aanwezig zijn, binden ze zich aan de ER, dimmen ze en binden ze zich aan de ERE, wat leidt tot transcriptie van het luciferase-gen. Bij toevoeging van een substraatoplossing katalyseert de luciferase een reactie die leidt tot fotonuitstoot. Daarom produceren positieve monsters lichte en negatieve monsters niet.
Deze commercieel beschikbare test elimineert de noodzaak voor laboratoria om de zoogdiercellen te transfecteren met het reporter-gen en oestrogeenreceptor13,14, die onstabiel en variabel was in werkzaamheid. De test biedt een stabiel transfectieplatform waarmee snel en eenvoudig kan worden bepaald of een plant oestrogene activiteit heeft via receptorbinding.
We testen de hypothese dat sojabonen een hogere oestrogene activiteit hebben dan alle andere voedingsmiddelen gezien hun bekende concentraties oestrogene isoflavonen15 met behulp van menselijk voedsel van lokale kruideniers.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ERβ-reportertest die is ontwikkeld om farmaceutische agentia individueel te screenen, is ook geschikt voor het screenen van plantaardig voedsel op fyto-oestrogenen die biologisch actief zijn via de ERβ. Belangrijke overwegingen in het protocol zijn onder meer het voorzichtig behandelen van de plantenmonsters: vers plantmateriaal moet snel worden gedroogd om schimmelvorming of andere biologische afbraak te voorkomen, en het moet uit de buurt van licht worden gehouden om fotolyse van de verbindingen te voorkomen<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs zijn Dale Leitman dankbaar voor de initiële training in het gebruik van voorbijgaande transfectietests om oestrogene activiteit van primatenplantaarde te bepalen. Met dank aan Bradford Westrich en C. Eric Johnson voor het helpen opzetten van laboratoriumapparatuur en het trainen van studenten in extractiemethoden. Tot slot, bedankt aan de Indiana University voor het financieren van dit onderzoek.
Materials
| 1000 µL pipette | |||
| 20 µL pipette | |||
| 200 µL pipette | |||
| 37 ℃ water bath | |||
| 37 ℃, humidified 5% CO2 incubator | |||
| 70% ethanol | |||
| analytical balance | |||
| cell culture-rated laminar flow hood | |||
| dimethyl sulfoxide | |||
| disposable media basin, sterile | |||
| drip filtration system | |||
| Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
| HPLC grade methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit – analyzes 24 samples plus standard curve |
| lyophilizer | |||
| multi-channel pipette | |||
| orbital shaker | |||
| plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
| rotory evaporator | |||
| round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
| sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
| sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
| Whatman grade 1 paper | |||
| whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |
References
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
- Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution. International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).
- DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal. Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).
- Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -. L., Lambert, J. E., Rothman, J. M. . Primate Diet & Nutrition. , (2020).
- Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys. African Journal of Ecology. , (2019).
- Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).
- Tubbs, C. W., et al. Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility. General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).
- Shen, M., et al. Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model. European Journal of Medical Research. 22 (1), 42 (2017).
- Boué, S. M., et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Nishikawa, J. -. i., et al. New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).
- . . Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , (2020).
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda. American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).
- Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3′-diindolylmethane. Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).
- Whitten, P. L., Patisaul, H. B. Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action. Environmental Health Perspectives. 109, 5-20 (2001).
- Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. . Advances in Food and Nutrition Research. , (2019).
- Lutz, I., Kloas, W. Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding. Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).
- Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).
- Jeng, Y. -. J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells. Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).
- Dixon, R. A. Phytoestrogens. Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).
- Kuiper, G. G. J. M., et al. Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β. Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).
- Wasserman, M. D. . Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , (2011).
- Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure. Reproduction. 143 (3), 247-260 (2012).
