Dépistage des phytoestrogènes à l’aide d’un récepteur d’œstrogènes à base β de Reporter Assay
Summary
Nous avons optimisé un récepteur d’oestrogène disponible dans le commerce β test de journaliste pour le criblage des nourritures humaines et non humaines de primate pour l’activité oestrogène. Nous avons validé cet essai en montrant que le soy humain oestrogène connu enregistre haut, alors que d’autres nourritures ne montrent aucune activité.
Abstract
Les plantes sont une source de nourriture pour de nombreux animaux, et elles peuvent produire des milliers de produits chimiques. Certains de ces composés affectent les processus physiologiques chez les vertébrés qui les consomment, comme la fonction endocrinienne. Les phytoestrogènes, les phytochimiques endocriniens actifs les plus étudiés, interagissent directement avec l’axe gonadal hypothalamo-pituitaire du système endocrinien vertébré. Ici nous présentons l’utilisation nouvelle d’un essai à base de cellules pour examiner des extraits de plante pour la présence des composés qui ont l’activité biologique oestrogène. Cet essai utilise des cellules mammifères conçues pour exprimer fortement la bêta des récepteurs d’oestrogène (ERβ) et qui ont été transfectées avec un gène de luciferase. L’exposition à des composés avec l’activité oestrogène a comme résultat les cellules produisant la lumière. Cet essai est un moyen fiable et simple de tester l’activité œstrogène biologique. Il a plusieurs améliorations sur les analyses transitoires de transfection, notamment, la facilité d’utilisation, la stabilité des cellules, et la sensibilité de l’analyse.
Introduction
Les plantes sont une source nécessaire de nourriture pour de nombreux animaux, fournissant des calories et des nutriments essentiels à la survie, la reproduction, la croissance, le développement et lecomportement 1. Les plantes produisent des milliers de produits chimiques, dont beaucoup sont des adaptations pour leur propre croissance, leur entretien stomatique et leur reproduction. D’autres composés, réputés métabolites secondaires végétaux (MSP), ont des fonctions moins claires, bien que certaines soient toxiques et probablement utilisées comme défense contre l’herbivorie et le parasitisme (p. ex., alcaloïdes, tanins)2,3. Certains de ces produits chimiques ont la capacité d’affecter les processus physiologiques à long terme chez les animaux, tels que le fonctionnement endocrinien, bien que pourquoi ces phytochimiques endocriniens actifs interagissent avec le système endocrinien vertébré n’est toujours pasclair 2,4.
Les phytoestrogènes, les phytochimiques endocriniens actifs les plus étudiés, sont des MSP polyphénoliques qui imitent structurellement et fonctionnellement les œstrogènes, interagissant directement avec l’axe gonadal hypothalomo-pituitaire du système endocrinien vertébré5. L’ingestion de phytoestrogènes dans l’alimentation humaine est associée à la protection contre certains cancers, maladies cardiaques et symptômes ménopausiques, bien que d’autres effets incluent des problèmes de fertilité. En fait, les effets physiologiques de ces composés ont été découverts dans les années 1940 lorsque l’infertilité chez les moutons a été attribuée à leur pâturage sur le trèfle riche en phytoestrogènes (Trifolium subterrareum)6. Lorsqu’ils sont ingérés, les phytoestrogènes peuvent passer dans les cellules et imiter les effets de l’œstrogène. Alors que les phytoestrogènes ont eu des effets négatifs sur la fertilité des moutons, la relation entre les phytoestrogènes et la physiologie n’est pas simple. Comme les moutons, les rhinocéros blancs du sud présentent une sensibilité aux composés oestrogènes dans les aliments dérivés de grandes quantités de sy et de luzerne. Les filles de femelles nourries à ce régime pendant la grossesse sont moins susceptibles de se reproduire7. Cependant, d’autres études ont prouvé que les phytoestrogens peuvent avoir des effets positifs aussi bien, y compris la maturation des follicules ovariens chez les sourisplus âgées 8,la prévention de certains cancers, activité antioxydante, et effets antiproliferatives9.
L’ampleur des effets des phytoestrogènes ne sont pas surprenants étant donné que les oestrogènes affectent un large éventail de fonctions biologiques, y compris la croissance, le développement et la régulation des systèmes nerveux reproducteur et central10. Bien qu’il existe de nombreux mécanismes d’action, les phytoestrogènes ont souvent la capacité de modifier, d’améliorer ou de perturber la signalisation des œstrogènes grâce à leur capacité d’agir comme ligands pour les récepteurs intranucléaires d’œstrogènes alpha et bêta (ERα et ERβ). Beaucoup de phytoestrogènes ont une structure phénolique d’anneau semblable aux oestrogènes qui leur permet de lier des récepteurs d’oestrogène. Ceux avec la fonction agoniste d’activité oestrogène comme l’oestrogène, formant un complexe activé d’ER-ligand qui peut dimerize et lier à un élément de réponse d’oestrogène (ERE) et déclencher la transcriptionde gène 11. Ainsi, les oestrogènes et les phytoestrogènes régulent l’activité cellulaire et le système fonctionne par leurs actions comme facteurs de transcription.
Ici nous présentons l’utilisation nouvelle d’un essai à base de cellules pour examiner des extraits de plante pour la présence des composés qui ont l’activité biologique oestrogène. Cet essai utilise des cellules cho d’ovaire de hamster chinois conçues pour exprimer fortement ERβ, qui ont été transfectées avec le gènede luciferase de luciferase de Photinus ( Photinus pyralis) lié à un promoteur d’ERE12. Quand les composés oestrogènes sont présents, ils se lient aux ER, dimerize, et se lient à l’ERE, menant à la transcription du gène de luciferase. Lors de l’ajout d’une solution de substrat, la luciferase catalyse une réaction conduisant à l’émission de photons. Par conséquent, les échantillons positifs produisent des échantillons légers et négatifs ne produisent pas.
Cet essai disponible dans le commerce élimine la nécessité pour les laboratoires de transfecter les cellules mammifères avec le gène reporter et le récepteur d’oestrogène13,14, qui était instable et variable dans l’efficacité. L’essai fournit une plate-forme stable de transfection qui permet de déterminer rapidement et simplement si une plante a l’activité oestrogène par l’intermédiaire de liaison de récepteur.
Nous testons l’hypothèse que le soja a une activité oestrogène plus élevée que tous les autres aliments étant donné leurs concentrations connues d’isoflavones oestrogènes15 en utilisant des aliments humains provenant d’épiciers locaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’essai de reporter ERβ développé pour filtrer individuellement les agents pharmaceutiques est également adapté pour le dépistage des aliments végétaux pour les phytoestrogènes biologiquement actifs par l’intermédiaire de l’ERβ. Les considérations importantes dans le protocole incluent le traitement des échantillons de plantes avec soin : le matériel végétal frais doit être séché rapidement pour empêcher le moulage ou toute autre dégradation biologique, et il doit être tenu à l’écart de la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants à Dale Leitman pour la formation initiale dans l’utilisation des analyses transitoires de transfection pour déterminer l’activité oestrogène des nourritures végétales de primate. Merci à Bradford Westrich et C. Eric Johnson d’avoir aidé à mettre en place de l’équipement de laboratoire et de former les étudiants aux méthodes d’extraction. Enfin, merci à l’Université de l’Indiana pour le financement de cette recherche.
Materials
| 1000 µL pipette | |||
| 20 µL pipette | |||
| 200 µL pipette | |||
| 37 ℃ water bath | |||
| 37 ℃, humidified 5% CO2 incubator | |||
| 70% ethanol | |||
| analytical balance | |||
| cell culture-rated laminar flow hood | |||
| dimethyl sulfoxide | |||
| disposable media basin, sterile | |||
| drip filtration system | |||
| Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
| HPLC grade methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit – analyzes 24 samples plus standard curve |
| lyophilizer | |||
| multi-channel pipette | |||
| orbital shaker | |||
| plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
| rotory evaporator | |||
| round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
| sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
| sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
| Whatman grade 1 paper | |||
| whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |
References
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