एक सेल आधारित एस्ट्रोजन रिसेप्टर β रिपोर्टर परख का उपयोग कर फाइटोएस्ट्रोजेन के लिए स्क्रीनिंग
Summary
हमने एस्ट्रोजेनिक गतिविधि के लिए मानव और अमानवीय रहनुमा खाद्य पदार्थों की स्क्रीनिंग के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एस्ट्रोजन रिसेप्टर β रिपोर्टर परख का अनुकूलन किया है। हमने यह दिखाकर इस परख को मान्य किया कि ज्ञात एस्ट्रोजेनिक मानव खाद्य सोया उच्च दर्ज करता है, जबकि अन्य खाद्य पदार्थ कोई गतिविधि नहीं दिखाते हैं।
Abstract
पौधे कई जानवरों के लिए भोजन का स्रोत हैं, और वे हजारों रसायनों का उत्पादन कर सकते हैं। इनमें से कुछ यौगिक कशेरुकी में शारीरिक प्रक्रियाओं को प्रभावित करते हैं जो उनका उपभोग करते हैं, जैसे कि एंडोक्राइन फ़ंक्शन। फाइटोएस्ट्रोजेन, सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किए गए एंडोक्राइन-सक्रिय फाइटोकेमिकल्स, कशेरुकी एंडोक्राइन सिस्टम के हाइपोथेलामो-पिट्यूटरी गोंडल अक्ष के साथ सीधे बातचीत करते हैं। यहां हम एस्ट्रोजेनिक जैविक गतिविधि वाले यौगिकों की उपस्थिति के लिए पौधे के अर्क को स्क्रीन करने के लिए सेल-आधारित परख का उपन्यास उपयोग प्रस्तुत करते हैं। यह परख अत्यधिक एस्ट्रोजन रिसेप्टर बीटा (ERο) व्यक्त करने के लिए इंजीनियर स्तनधारी कोशिकाओं का उपयोग करता है और है कि एक लूसिफ़ेरेस जीन के साथ संक्रमित किया गया है । एस्ट्रोजेनिक गतिविधि के साथ यौगिकों के संपर्क में आने से कोशिकाओं में प्रकाश का उत्पादन होता है। यह परख जैविक एस्ट्रोजेनिक गतिविधि के लिए परीक्षण करने का एक विश्वसनीय और सरल तरीका है। इसमें क्षणिक ट्रांसफेक्शन पर कई सुधार हैं, सबसे विशेष रूप से, उपयोग में आसानी, कोशिकाओं की स्थिरता, और परख की संवेदनशीलता।
Introduction
पौधे कई जानवरों के लिए भोजन का एक आवश्यक स्रोत हैं, जो जीवित रहने, प्रजनन, विकास, विकास और व्यवहार के लिए महत्वपूर्ण कैलोरी और पोषक तत्व प्रदानकरते हैं। पौधे हजारों रसायनों का उत्पादन करते हैं, कई अपने स्वयं के विकास, स्स्टेमैटिक रखरखाव और प्रजनन के लिए अनुकूलन के रूप में। अन्य यौगिकों, समझा संयंत्र माध्यमिक चयापचय (PSMs), कार्य है कि कम स्पष्ट कर रहे हैं, हालांकि कुछ विषाक्त और संभावना शाकाहारी और परजीवीवाद के खिलाफ एक रक्षा के रूप में इस्तेमाल कर रहे है (जैसे, क्षारीय, टैनिन)2,3। इनमें से कुछ रसायनों में जानवरों में दीर्घकालिक शारीरिक प्रक्रियाओं को प्रभावित करने की क्षमता होती है, जैसे एंडोक्राइन कार्यप्रणाली, हालांकि ये एंडोक्राइन-एक्टिव फाइटोकेमिकल्स कशेरुकी एंडोक्राइन सिस्टम के साथ बातचीत क्यों करतेहैं,यह अभी भी अस्पष्ट है2,4।
फाइटोएस्ट्रोजेन्स, सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किए गए एंडोक्राइन-एक्टिव फाइटोकेमिकल्स, पॉलीफेनोलिक पीएसएम हैं जो संरचनात्मक रूप से और कार्यात्मक रूप से एस्ट्रोजेन की नकल करते हैं, सीधे कशेरुकी एंडोक्राइन सिस्टम5के हाइपोथलोमो-पिट्यूटरी गोनाडल धुरी के साथ बातचीत करते हैं। मानव आहार में फाइटोएस्ट्रोजेन का घूस कुछ कैंसर, हृदय रोग और रजोनिवृत्ति के लक्षणों के खिलाफ सुरक्षा से जुड़ा हुआ है, हालांकि अन्य प्रभावों में प्रजनन संबंधी समस्याएं शामिल हैं। वास्तव में, इन यौगिकों के शारीरिक प्रभाव 1940 के दशक में खोज रहे थे जब भेड़ में बांझपन फाइटोएस्ट्रोजन से भरपूर क्लोवर(ट्राइफोलियम सबटेरेरियम)6पर उनके चराई के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था । जब निगला जाता है, फाइटोएस्ट्रोजेन कोशिकाओं में पारित कर सकते हैं और एस्ट्रोजन के प्रभाव की नकल कर सकते हैं। जबकि फाइटोएस्ट्रोजेन का भेड़ प्रजनन क्षमता पर नकारात्मक प्रभाव पड़ा, फाइटोएस्ट्रोजेन और शरीर विज्ञान के बीच संबंध सरल नहीं है। भेड़ की तरह, दक्षिणी सफेद गैंडा सोया और अल्फाल्फा की उच्च मात्रा से प्राप्त फ़ीड में एस्ट्रोजेनिक यौगिकों के प्रति संवेदनशीलता प्रदर्शित करता है। गर्भावस्था के दौरान इस आहार को खिलाई जाने वाले महिलाओं की बेटियों में7प्रजनन की संभावना कम होती है . हालांकि, अन्य अध्ययनों से पता चला है कि फाइटोएस्ट्रोजेन का सकारात्मक प्रभाव भी हो सकता है, जिसमें पुराने चूहों में अंडाशय के रोम की परिपक्वता8,कुछ कैंसर की रोकथाम, एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि और एंटीप्रोलाइफेटिव प्रभाव9शामिल हैं।
फाइटोएस्ट्रोजेन के प्रभावों की चौड़ाई आश्चर्य की बात नहीं है कि एस्ट्रोजेन प्रजनन और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र10के विकास, विकास और विनियमन सहित जैविक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला को प्रभावित करते हैं। यद्यपि कार्रवाई के कई तंत्र हैं, फाइटोएस्ट्रोजेन में अक्सर इंट्रान्यूक्लियर एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स अल्फा और बीटा (ईआरα और ईआर) के लिए लिगांड के रूप में कार्य करने की क्षमता के माध्यम से एस्ट्रोजन सिग्नलिंग को संशोधित करने, बढ़ाने या बाधित करने की क्षमता होती है। कई फाइटोएस्ट्रोजेन में एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स को बांधने की अनुमति देने वाले एस्ट्रोजेन के समान फेनोलिक रिंग संरचना होती है। एस्ट्रोजन की तरह एगोनिस्टिक एस्ट्रोजेनिक गतिविधि कार्य करने वाले लोग एक सक्रिय ईआर-लिगांड कॉम्प्लेक्स बनाते हैं जो एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया तत्व (ईईआरई) से प्रसारित और बांध सकता है और जीन ट्रांसक्रिप्शन11को ट्रिगर कर सकता है। इस प्रकार, एस्ट्रोजेन और फाइटोएस्ट्रोजेन प्रतिलेखन कारकों के रूप में अपने कार्यों के माध्यम से सेल गतिविधि और प्रणाली कार्यों को विनियमित करते हैं।
यहां हम एस्ट्रोजेनिक जैविक गतिविधि वाले यौगिकों की उपस्थिति के लिए पौधे के अर्क को स्क्रीन करने के लिए सेल-आधारित परख का उपन्यास उपयोग प्रस्तुत करते हैं। यह परख चीनी हम्सटर अंडाशय चो कोशिकाओं का उपयोग करता है जो अत्यधिक ईरा व्यक्त करने के लिए इंजीनियर हैं, जो जुगनू(फोटिनस पाइरेलिस)लूसिफ़ेरेस जीन से संक्रमित हुए हैं जो एक एरे प्रमोटर12से जुड़े हैं। जब एस्ट्रोजेनिक यौगिक मौजूद होते हैं, तो वे ईआर से बांधते हैं, डिमराइज करते हैं, और ईरी से बांधते हैं, जिससे लूसिफ़ेरेस जीन का ट्रांसक्रिप्शन होता है। सब्सट्रेट समाधान के अतिरिक्त होने पर, लूसिफ़ेरेस एक प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करता है जिससे फोटॉन उत्सर्जन होता है। इसलिए, सकारात्मक नमूने प्रकाश का उत्पादन करते हैं और नकारात्मक नमूने नहीं करते हैं।
यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध परख प्रयोगशालाओं के लिए रिपोर्टर जीन और एस्ट्रोजन रिसेप्टर13, 14के साथ स्तनधारी कोशिकाओं को स्थानांतरित करने की आवश्यकता को समाप्त करता है, जो प्रभावकारिता में अस्थिर और परिवर्तनीय था। परख एक स्थिर ट्रांसफेक्शन प्लेटफॉर्म प्रदान करती है जो जल्दी से और बस यह निर्धारित करती है कि रिसेप्टर बाइंडिंग के माध्यम से एक पौधे में एस्ट्रोजेनिक गतिविधि है या नहीं।
हम इस परिकल्पना का परीक्षण करते हैं कि सोयाबीन में स्थानीय ग्रॉसर्स से मानव खाद्य पदार्थों का उपयोग करके एस्ट्रोजेनिक आइसोफ्लावोन15 की ज्ञात सांद्रता को देखते हुए अन्य सभी खाद्य पदार्थों की तुलना में उच्च एस्ट्रोजेनिक गतिविधि होती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
व्यक्तिगत रूप से दवा एजेंटों को स्क्रीन करने के लिए विकसित ERο रिपोर्टर परख भी ERο के माध्यम से जैविक रूप से सक्रिय फाइटोएस्ट्रोजेन के लिए संयंत्र खाद्य पदार्थों की स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है। प्रोटोक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक क्षणिक ट्रांसफेक्शन परख के उपयोग में प्रारंभिक प्रशिक्षण के लिए डेल Leitman के आभारी हैं रहनुमा संयंत्र खाद्य पदार्थों की एस्ट्रोजेनिक गतिविधि का निर्धारण करने के लिए । प्रयोगशाला उपकरण स्थापित करने और निष्कर्षण विधियों में छात्रों को प्रशिक्षित करने में मदद करने के लिए ब्रैडफोर्ड वेस्टरिच और सी एरिक जॉनसन के लिए धन्यवाद। अंत में, इस शोध के वित्तपोषण के लिए इंडियाना विश्वविद्यालय को धन्यवाद।
Materials
| 1000 µL pipette | |||
| 20 µL pipette | |||
| 200 µL pipette | |||
| 37 ℃ water bath | |||
| 37 ℃, humidified 5% CO2 incubator | |||
| 70% ethanol | |||
| analytical balance | |||
| cell culture-rated laminar flow hood | |||
| dimethyl sulfoxide | |||
| disposable media basin, sterile | |||
| drip filtration system | |||
| Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
| HPLC grade methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit – analyzes 24 samples plus standard curve |
| lyophilizer | |||
| multi-channel pipette | |||
| orbital shaker | |||
| plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
| rotory evaporator | |||
| round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
| sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
| sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
| Whatman grade 1 paper | |||
| whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |
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