Обратная транскрипция петли-опосредованное Изотермальная усиление (RT-LAMP) Ассадля для специфического и быстрого обнаружения вируса озера Тилапия
Summary
Мы представляем RT-LAMP анализ для обнаружения TiLV в тилапии рыбы с использованием простых инструментов в течение относительно короткого периода времени по сравнению с обычными методами RT-PCR. Этот протокол может помочь в борьбе с эпидемическим распространением TiLVD, особенно в развивающихся странах.
Abstract
Болезнь озерного озера Тилапия (TiLVD), зарождающееся вирусное заболевание в тилапии, вызванное вирусом озера тилапия (TiLV), является постоянной проблемой в аквакультуре, которая привела к массовой заболеваемости и смертности тилапии во многих частях мира. Таким образом, для выявления первоначальной инфекции и предотвращения распространения заболевания в аквакультурном сельском хозяйстве необходим эффективный, быстрый и точный диагностический тест на инфекцию TiLV. В этом исследовании, очень чувствительныи и практические обратной транскрипции цикл опосредованного изотермального усиления (RT-LAMP) метод представлен для обнаружения вируса озера тилапии в рыбной ткани. Сравнение анализов RT-qPCR и RT-LAMP инфицированных образцов показало положительные результаты в 63 (100%) и 51 (80.95%) образцы, соответственно. Кроме того, анализ неинфицированных образцов показал, что все 63 неинфицированных тканей дали отрицательные результаты как для анализов РТ-кПЦР, так и для RT-LAMP. Перекрестная реактивность с пятью патогенами в тилапии оценивалась с помощью RT-LAMP, и все тесты показали отрицательные результаты. Оба печени и слизи образцов, полученных из инфицированных рыб показали сопоставимые результаты с помощью метода RT-LAMP, предполагая, что слизь может быть использована в RT-LAMP как нелетальный ассс, чтобы избежать убийства рыбы. В заключение, результаты показали, что представленный анализ RT-LAMP обеспечивает эффективный метод для обнаружения TiLV в ткани тилапии в течение 1 ч. Поэтому метод рекомендуется в качестве скринингового инструмента на фермах для быстрой диагностики TiLV.
Introduction
Болезнь озера Tilapia (TiLVD) является вирусным заболеванием в тилапии(Oreochromis spp.), которая, как сообщается, вызывает смерть от тилапии во многих регионах мира, включая Азию1,2, Африку и Америку. Болезнь была впервые признана во время массовой смертности тилапии в 2009 году в Израиле, где количество диких тилапий в озере Киннерет резко упало с 257 до 8 тонн в год2. Болезнь вызвана вирусом озера Тилапия (TiLV), который был назначен семье Amnoonviridae как новый род Tilapinevirus и новый вид Tilapia tilapinevirus3. Генетическая характеристика TiLV показала, что вирус является новым окутанным, отрицательным смыслом, одноцепочечным РНК-вирусом, который имеет 10 сегментов, кодирующих 10 белков1,,2,,4. Различные виды тилапии в роду Sarotherodon, Oreochromis, и Тилапин и другие теплые рыбы воды (например, гигантские гурами (Osphronemus goramy)) было показано, чтобы быть восприимчивыми к TiLV2,5. В настоящее время этот вирус продолжает распространяться по всему миру, возможно, через движение инфицированных живой рыбы6,7, в то время как риск вирусной передачи через замороженные тилапии или его продукт ограничен8. Существенная смертность от инфекции TiLV может оказать значительно пагубное экономическое воздействие на индустрию тилапии. Например, экономический эффект от летнего синдрома смертности в Египте, связанный с инфекцией TiLV, был рассчитан на US$100 млн9. Соответственно, важно разработать быстрый и надлежащий метод диагностики для облегчения борьбы с этим заболеванием в рыбоводных хозяйствах.
До сих пор диагноз TiLVD был основан на молекулярных анализах, вирусной изоляции и гистопатологии. Для диагностики TiLV10,,11были разработаны различные протоколы ПЦР и грунтовки. Например, sYBR зеленый основе обратной транскрипции количественного ПЦР (RT-qPCR) метод с чувствительностью для обнаружения всего лишь две копии / КЛ вируса была разработана и проверена для обнаружения TiLV10. Другие методы ПЦР для обнаружения TiLV включают TaqMan количественные PCR11, RT-PCR2, вложенный RT-PCR12, и полу-гнездо RT-PCR13. Однако эти методы требуют сложного лабораторного оборудования и относительно длительных периодов времени для получения результатов из-за сложности реакций, что делает их непригодными для применения на местах.
Цикл опосредованное изотермального усиления (LAMP) анализ является быстрым, простым и практичным для поля применения14,15. Техника использует принцип реакции смещения нити, в то время как реакция усиления проходит в изотермических условиях без сложного и дорогого теплового циклизатора14,15. Следовательно, усиленные продукты LAMP или продукты RT-LAMP анализируются в трапа-подобных полосах с использованием электрофореза геля агарозы с флуоресцентным пятном либо для безопасной визуализации ДНК или РНК14, либо наблюдения невооруженным глазом за наличие мутной или белой осадки16,17,18. По этим причинам данная методика была использована для обнаружения на месте различных рыбных патогенов17,,18,,19,,20,,21,,22,,23,,24,,25,,26,,27. Целью данного исследования было создание быстрого, чувствительного и точного исследования RT-LAMP для обнаружения TiLV. Анализ RT-LAMP предлагает скрининг на TiLV в образцах рыбы в течение 30 минут. Методика может быть применена для диагностики и наблюдения TiLVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Аквакультура промышленности постоянно находится под угрозой вирусных инфекций, которые вызывают значительные экономические потери9,23,28. Например, возникающие TiLV представляет собой серьезную угрозу для тилапии-производителей во мног…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Проект финансируется финансово Таиланд исследовательский фонд (TRF) грант номер RDG6050078 и Центр передовых исследований в области сельского хозяйства и продовольствия, Институт перспективных исследований, Университет Касетарт, Бангкок, Таиланд в рамках высшего образования научно-исследовательский фонд и Национальный исследовательский университет проекта Таиланда, Управление Высшего образования комиссии, Министерство образования, Таиланд. Исследование частично поддерживается стипендией для выпускников Высшей школы, Университет Касетсарта. Авторы хотели бы поблагодарить доктора Кванрави Сириканчана за рассказ о видео и Piyawatchara Сикарина для редактирования видео.
Materials
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| – Direct-zol RNA PreWash | |||
| – RNA Wash Buffer | |||
| – DNase/RNase-free water | |||
| – Zymo-spin IIICG columns | |||
| – Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| – Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| – Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| – Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
References
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
- Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
- Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
- Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
- Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , (2017).
- Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
- Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
- Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality’ syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
- Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
- Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
- Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
- Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
- Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
- Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
- Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
- Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
- Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
- Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. 발생학. 121, 255-261 (2005).
- Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
- Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
- Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
- Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
- Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).
