JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
면역학 및 감염병학

Tilapia Lake Virüs Ünün Özel ve Hızlı Tespiti İçin Ters Transkripsiyon Döngü Aracılı İzomal Amplifikasyon (RT-LAMP) Testi

Published: May 18, 2020
doi:
10.3791/61025
, , , ,
1Department of Biotechnology, Faculty of Applied Science,King Mongkut’s University of Technology North Bangkok (KMUTNB), 2Department of Veterinary Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine,Kasetsart University, 3Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies,Kasetsart University, 4Department of Chemical and Process Engineering, The Sirindhorn Thai-German International Graduate School of Engineering (TGGS),King Mongkut’s University of Technology North Bangkok (KMUTNB)

Summary

Geleneksel RT-PCR tekniklerine göre nispeten kısa bir süre boyunca basit aletler kullanarak tilapia balıklarında TiLV tespiti için bir RT-LAMP tayini salıyoruz. Bu protokol, özellikle gelişmekte olan ülkelerde TiLVD’nin salgınının kontrol altına alabiliyor.

Abstract

Tilapia lake virus (TiLV) tarafından ortaya çıkan tilapia viral hastalığı olan Tilapia lake virus hastalığı (TiLVD), dünyanın birçok yerinde tilapia’nın kitlesel morbidite ve mortalitelerine yol açan kültür balıkçılığı endüstrisinde kalıcı bir sorundur. Bu nedenle tilv enfeksiyonu için etkili, hızlı ve doğru bir tanı testi ilk enfeksiyonu tespit etmek ve kültür balıkçılığı tarımında hastalığın yayılmasını önlemek için gereklidir. Bu çalışmada balık dokusunda tilapia göl virüsünü saptamak için son derece hassas ve pratik ters transkripsiyon döngü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) yöntemi sunulmuştur. Enfekte örneklerin RT-qPCR ve RT-LAMP testlerinin karşılaştırılmasında 63 (%100) pozitif sonuç saptandı. ve 51 (%80,95) örnekleri, sırasıyla. Ayrıca, enfekte edilmemiş örneklerin analizi, 63 enfekte olmayan mendilin hem RT-qPCR hem de RT-LAMP tahlilleri için olumsuz sonuçlar verdiğini göstermiştir. Tilapia beş patojenile çapraz reaktivite RT-LAMP kullanılarak değerlendirildi ve tüm testler de negatif sonuçlar gösterdi. Enfekte balıklardan alınan karaciğer ve mukus örnekleri RT-LAMP yöntemi kullanılarak karşılaştırılabilir sonuçlar göstererek, mukusların rt-LAMP’de balık öldürmemek için öldürücü olmayan bir tahkikat olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir. Sonuç olarak, sunulan RT-LAMP tahsinin tilapia dokusunda TiLV tespiti için etkili bir yöntem sağladığını göstermiştir. Bu nedenle bu yöntem, TiLV’nin hızlı tanısı için çiftliklerde bir tarama aracı olarak önerilir.

Introduction

Tilapia lake virus disease (TiLVD) tilapia viral bir hastalıktır(Oreochromis spp.) bildirildiğine göre Asya1dahil olmak üzere dünyanın birçok bölgesinde tilapia ölümlerine nedenolan,Dahil Asya 1 ,2,Afrika, ve Amerika. Hastalık ilk olarak 2009 yılında İsrail’de tilapia’nın kitlesel mortalitesi sırasında tanındı ve Kinneret Gölü’ndeki yabani tilapia sayısıyılda257’den 8 tona düştü. Hastalık tilapia göl virüsü neden olur (TiLV), hangi aile Amnoonviridae yeni bir cins Tilapinevirus ve yeni bir tür Tilapia tilapinevirusolarak atanmıştır3. TiLV genetik karakterizasyonu virüs 10 proteinler1,2,,4kodlama 10 segmentleri olan yeni bir zarflı, negatif-sense, tek iplikli RNA virüsü olduğunu gösterdi. Sarotherodoncinsi tilapia çeşitli türler , Oreochromis, ve Tilapine ve diğer sıcak su balıkları (örneğin, dev gourami(Osphronemus goramy)) TiLV duyarlı olduğu gösterilmiştir2,5. Şu anda, bu virüs küresel yayılmaya devam ediyor, muhtemelen enfekte canlı balık hareketi ile6,7, dondurulmuş tilapia veya ürün yoluyla viral iletim riski sınırlı iken8. TiLV enfeksiyonuna bağlı önemli mortalite, tilapia endüstrisi üzerinde önemli ölçüde zararlı bir ekonomik etkiye sahip olabilir. Örneğin, Mısır’da TiLV enfeksiyonu ile ilişkili yaz mortalite sendromunun ekonomik etkisi 100milyon9 ABD Doları olarak hesaplanmıştır. Bu nedenle balık çiftliklerinde bu hastalığın kontrolünü kolaylaştırmak için hızlı ve uygun bir tanı yöntemi geliştirmek önemlidir.

Şimdiye kadar TiLVD tanısı moleküler tahliller, viral izolasyon ve histopatolojiye dayanıyordu. TiLV tanısı için farklı PCR protokolleri ve astarları geliştirilmiştir10,11. Örneğin, bir SYBR yeşil tabanlı ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) yöntemi gibi az iki kopya / μL virüsün algılama duyarlılığı ile geliştirilmişve TiLV algılama için doğrulanmıştır10. TiLV tespiti için diğer PCR yöntemleri TaqMan kantitatif PCR11, RT-PCR2, iç içe RT-PCR12, ve yarı iç içe RT-PCR13içerir. Ancak, bu yöntemler, reaksiyonların karmaşıklığı nedeniyle sonuç vermek için gelişmiş laboratuvar ekipmanı ve nispeten uzun süreler gerektirir, bu da onları saha uygulaması için uygun hale getirir.

Döngü aracılı izomal amplifikasyon (LAMP) testi hızlı, basit ve pratik alan uygulaması14,15. Teknik bir iplikçik yer değiştirme reaksiyonu prensibini kullanır, amplifikasyon reaksiyonu gelişmiş ve pahalı termal döngücü14olmadan izotermal koşullar altında çalışır iken,15. Sonuç olarak, güçlendirilmiş LAMP ürünleri veya RT-LAMP ürünleri, DNA veya RNA14’ün güvenli görüntülenmesi için floresan leke li agarose jel elektroforezi kullanılarak merdiven benzeri bantlarda veya bulanıklık veya beyaz çökelti 16,17,18varlığı için çıplak gözle gözlem de analiz edilir.18 Bu nedenlerden dolayı, bu teknik farklı balık patojenlerinin yerinde tespiti için kullanılmıştır17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Bu çalışmanın amacı TiLV tespiti için hızlı, hassas ve doğru bir RT-LAMP testi oluşturmaktır. RT-LAMP tne30 dakika içinde balık örneklerinde TiLV için tarama sunuyor. TiLVD tanı ve gözetimi için teknik uygulanabilir.

Protocol

Hayvan dokusu kullanımını içeren bu deney, Bangkok, Tayland’daki Kasetsart Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (protokol numarası ACKU61-VET-009). 1. Doku toplama Aşırı dozda karanfil yağı (yani 3 mL/L’den fazla) kullanarak tilapia balığı namına ötenazi. Triain metansülfonat karanfil yağı alternatif olarak kullanılabilir. Postmortem tilapia’nın karnını açmak ve yaklaşık 30-50 mg karaciğer dokusu ?…

Representative Results

Bu çalışmada tilapia’da TiLV enfeksiyonunu saptamak için rt-LAMP teşbelli geliştirilmiştir. Test edilen numuneler 2015-2016 yılları arasında Tayland’ın farklı bölgelerinde bulunan 14 çiftlikten toplanmıştır. Enfekte ve enfekte olmayan balıklar öncelikle fiziksel tanılara ve semptomatik TiLVD’nin görünüşüne göre gruplandı. TiLV enfeksiyonu daha sonra toplama işleminden sonra RT-PCR kullanılarak doğrulandı. Agarose jel elektroforezi ve Parlak yeşil rengin saptanması LAMP amfikonslarının d…

Discussion

Kültür balıkçılığı endüstrisi sürekli önemli ekonomikkayıplaraneden viral enfeksiyonlar tarafından tehdit edilir9,23,28. Örneğin, ortaya çıkan TiLV dünyanın birçok yerinde tilapia üreten ülkeler için büyük bir tehdit oluşturmaktadır1,6,9. Şimdiye kadar, TiLVD önlemek için özel bir tedavi mevcut olmuştur. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Proje mali Tayland Araştırma Fonu (TRF) hibe numarası RDG6050078 ve Merkezi Tarım ve Gıda İleri Çalışmalar, İleri Çalışmalar Enstitüsü, Kasetsart Üniversitesi, Bangkok, Tayland Yüksek Öğretim Araştırma Teşvik ve Ulusal Araştırma Üniversitesi Projesi, Yüksek Öğretim Komisyonu Ofisi, Eğitim Bakanlığı, Tayland altında finanse edilmektedir. Araştırma kısmen Kasetsart Üniversitesi Lisansüstü Programı Bursu ile desteklenmiştir. Yazarlar dr Kwanrawee Sirikanchana video ve Piyawatchara Sikarin video düzenleme için konuşma için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Tissue collection:
Clove oil Better Pharma N/A
Tricaine methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 An alternative option to clove oil
RNA extraction:
Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) ThermoFisher Scientific Corp. 15596026
Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) Geneaid GZR100
Direct-zol RNA Kit: Zymo Research R2071
– Direct-zol RNA PreWash
– RNA Wash Buffer
– DNase/RNase-free water
– Zymo-spin IIICG columns
– Collection Tubes
RT-LAMP:
1x SD II reaction buffer Biotechrabbit BR1101301
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich 7487-88-9
dNTP set Bioline BIO-39053
Betaine Sigma-Aldrich B2629
Calcein mixture Merck 1461-15-0
Bst DNA polymerase Biotechrabbit BR1101301
AMV reverse transcriptase Promega M510A
Nuclease-free water Invitrogen 10320995
Elite dry bath incubator, single unit Major Science EL-01-220
Gel electrophoresis:
Agarose Vivantis Technologies PC0701-500G
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer Sigma-Aldrich SRE0062
Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer:
– Tris Vivantis Technologies PR0612-1KG
– Acetic acid (glacial), EMSURE Merck Millipore 1000632500
– Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec Sigma-Aldrich V800170-500G
Neogreen NeoScience Co., Ltd. GR107
DNA gel loading dye (6X) ThermoFisher Scientific Corp. R0611
DNA ladder and markers Vivantis Technologies PC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) Bio-Rad 1704487
PowerPac HC power supply Bio-Rad 1645052
Gel Doc EZ System Bio-Rad 1708270
UV sample tray Bio-Rad 1708271
NαBI imager Neogene Science
cDNA synthesis:
ReverTra Ace qPCR RT Kit Toyobo FSQ-101
Viva cDNA Synthesis Kit Vivantis Technologies cDSK01 An alternative option for cDNA synthesis
NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) ThermoFisher Scientific Corp. ND-2000
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725120
Nuclease-free water, sterile water MultiCell 809-115-CL
8-tube PCR strips, white Bio-Rad TLS0851
Flat PCR tube 8-cap strips, optical Bio-Rad TCS0803
CFX96 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1855196
General equipment and materials:
Mayo scissors N/A
Forceps N/A
Vortex Genie 2 (vortex mixer) Scientific Industries
Microcentrifuge LM-60 LioFuge CM610
Corning LSE mini microcentrifuge Corning 6765
Pipettes Rainin Pipete-Lite XLS
QSP filtered pipette tips Quality Scientific Plastics TF series
Corning Isotip filtered tips Merck CLS series
Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST Wuxi NEST Biotechnology 615601
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
  2. Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
  3. Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
  4. Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
  5. Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
  6. Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , (2017).
  7. Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
  8. Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
  9. Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality’ syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
  10. Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
  11. Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
  12. Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
  13. Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
  14. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
  15. Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
  16. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
  17. Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
  18. Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
  19. Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
  20. Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
  21. Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
  22. Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
  23. Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
  24. Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
  25. Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
  26. Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
  27. Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
  28. Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. 발생학. 121, 255-261 (2005).
  29. Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
  30. Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
  31. Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
  32. Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
  33. Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
  34. Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
  35. Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
  36. Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
  37. Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
  38. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  39. Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).

Tags

RT-LAMPReverse Transcription Loop-mediated Isothermal AmplificationTilapia Lake VirusTiLVRapid DetectionRNA ExtractionPrimer DesignPrimerExplorerLAMP PrimersSegment 3AquacultureTilapiaVirus Detection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Phusantisampan, T., Rawiwan, P., Roy, S. R. K., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus. J. Vis. Exp. (159), e61025, doi:10.3791/61025 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image