Ensaio de amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP) para a detecção específica e rápida do vírus do lago tilápia
Summary
Apresentamos um ensaio RT-LAMP para a detecção de TiLV em peixes de tilápia usando instrumentos simples durante um período relativamente curto de tempo em comparação com as técnicas convencionais de RT-PCR. Este protocolo pode ajudar a controlar a propagação epidêmica do TiLVD, especialmente nos países em desenvolvimento.
Abstract
A doença do vírus do lago tilápia (TiLVD), uma doença viral emergente na tilápia causada pelo vírus do lago tilápia (TiLV), é um desafio persistente na indústria da aquicultura que resultou na morbidade e mortalidade em massa da tilápia em muitas partes do mundo. Um ensaio diagnóstico eficaz, rápido e preciso para a infecção por TiLV é, portanto, necessário para detectar a infecção inicial e prevenir a propagação da doença na aquicultura. Neste estudo, um método de amplificação isotérmica mediada em loop de transcrição reversa altamente sensível e prática (RT-LAMP) é apresentado para detectar o vírus do lago tilápia no tecido dos peixes. A comparação dos ensaios RT-qPCR e RT-LAMP das amostras infectadas revelou resultados positivos em 63 (100%) e 51 (80,95%) amostras, respectivamente. Além disso, uma análise das amostras não infectadas mostrou que todos os 63 tecidos não infectados apresentaram resultados negativos tanto para os ensaios RT-qPCR quanto RT-LAMP. A reatividade cruzada com cinco patógenos na tilápia foi avaliada por rt-lamp, e todos os testes mostraram resultados negativos. Tanto as amostras de fígado quanto de muco obtidas de peixes infectados apresentaram resultados comparáveis usando o método RT-LAMP, sugerindo que o muco pode ser usado em RT-LAMP como um ensaio não letal para evitar matar peixes. Em conclusão, os resultados demonstraram que o ensaio RT-LAMP apresentado fornece um método eficaz para detecção de TiLV em tecido de tilápia no prazo de 1h. Por conseguinte, o método é recomendado como ferramenta de triagem nas fazendas para o diagnóstico rápido do TILV.
Introduction
A doença do vírus do lago tilápia (TiLVD) é uma doença viral na tilápia (Oreochromis spp.) que supostamente causa mortes por tilápia em muitas regiões do mundo, incluindo Ásia1,2, África e América. A doença foi reconhecida pela primeira vez durante a mortalidade em massa da tilápia em 2009 em Israel, onde o número de tilápiasilvestre no Lago Kinneret despencou drasticamente de 257 para 8 toneladas por ano2. A doença é causada pelo vírus do lago tilápia (TiLV), que foi atribuído à família Amnoonviridae como um novo gênero tilápide e uma nova espécie tilápide tilápide3. A caracterização genética do TiLV mostrou que o vírus é um novo vírus RNA de sentido negativo, de sentido único, que tem 10 segmentos codificando 10 proteínas1,2,4. Várias espécies de tilápia do gênero Sarotherodon, Oreochromis, tilapine e outros peixes de água quente (por exemplo, gourami gigante(Osphronemus goramy))mostraram-se suscetíveis ao TiLV2,5. Atualmente, esse vírus continua a se espalhar globalmente, possivelmente através do movimento de peixes vivos infectados6,7, enquanto o risco de transmissão viral através de tilápia congelada ou seu produto é limitado8. A mortalidade substancial por infecção por TiLV tem o potencial de ter um impacto econômico significativamente prejudicial na indústria da tilápia. Por exemplo, o impacto econômico da síndrome da mortalidade no verão no Egito associado à infecção por TiLV foi calculado em US$ 100 milhões9. Nesse meio tempo, é importante desenvolver um método de diagnóstico rápido e adequado para facilitar o controle dessa doença nas fazendas de peixes.
Até agora, o diagnóstico de TiLVD foi baseado em ensaios moleculares, isolamento viral e histopatologia. Diferentes protocolos de PCR e primers foram desenvolvidos para o diagnóstico tilv10,11. Por exemplo, um método de PCR quantitativo de transcrição reversa baseado em verde SYBR (RT-qPCR) com sensibilidade para detectar apenas duas cópias/μL do vírus foi desenvolvido e validado para detecção de TiLV10. Outros métodos de PCR para detecção de TiLV incluem o PCR quantitativo TaqMan11,RT-PCR2,o NS-PCR12aninhado e o RT-PCR13semi-aninhado . No entanto, esses métodos requerem equipamentos de laboratório sofisticados e períodos relativamente longos de tempo para produzir resultados devido à complexidade das reações, o que os torna inadequados para a aplicação em campo.
O ensaio de amplificação isotérmica (LAMP) mediado por loop é uma aplicação rápida, simples e prática para o campo14,15. A técnica emprega o princípio de uma reação de deslocamento de fios, enquanto a reação de amplificação corre sob condições isotérmicas sem um ciclo térmico sofisticado e caro14,15. Consequentemente, produtos LAMP amplificados ou produtos RT-LAMP são analisados em bandas semelhantes a escadas usando eletroforese de gel de agarose com uma mancha fluorescente para visualização segura de DNA ou RNA14 ou observação a olho nu para a presença de turbidez ou um precipitado branco16,17,18. Por essas razões, esta técnica tem sido utilizada para a detecção in loco de diferentes patógenos de peixes17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. O objetivo deste estudo foi estabelecer um ensaio RT-LAMP rápido, sensível e preciso para detecção de TiLV. O ensaio RT-LAMP oferece triagem para TiLV em amostras de peixes dentro de 30 min. A técnica pode ser aplicada para o diagnóstico e vigilância do TiLVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
A indústria da aquicultura está continuamente ameaçada por infecções virais que causam perdas econômicas substanciais9,,23,28. Por exemplo, o TiLV emergente representa uma grande ameaça aos países produtores de tilápia em muitas partes do mundo1,6,9. Até agora, não há terapêuticaespecífica disponível para prevenir o TiLVD…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O projeto é financiado financeiramente pelo Fundo de Pesquisa da Tailândia (TRF) número de subvenção RDG6050078 e o Centro de Estudos Avançados para Agricultura e Alimentação, Instituto de Estudos Avançados, Universidade de Kasetsart, Bangkok, Tailândia sob o Projeto de Pesquisa de Pesquisa de Ensino Superior e Nacional da Universidade de Pesquisa da Tailândia, Escritório da Comissão de Educação Superior, Ministério da Educação, Tailândia. A pesquisa é apoiada em parte pela Bolsa de Pós-Graduação da Escola de Pós-Graduação da Universidade Kasetsart. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Kwanrawee Sirikanchana pela narrativa falando do vídeo e Piyawatchara Sikarin pela edição do vídeo.
Materials
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| – Direct-zol RNA PreWash | |||
| – RNA Wash Buffer | |||
| – DNase/RNase-free water | |||
| – Zymo-spin IIICG columns | |||
| – Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| – Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| – Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| – Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
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