JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
면역학 및 감염병학

Omvendt transskription Loop-medieret Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for den specifikke og hurtige påvisning af Tilapia Lake Virus

Published: May 18, 2020
doi:
10.3791/61025
, , , ,
1Department of Biotechnology, Faculty of Applied Science,King Mongkut’s University of Technology North Bangkok (KMUTNB), 2Department of Veterinary Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine,Kasetsart University, 3Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies,Kasetsart University, 4Department of Chemical and Process Engineering, The Sirindhorn Thai-German International Graduate School of Engineering (TGGS),King Mongkut’s University of Technology North Bangkok (KMUTNB)

Summary

Vi præsenterer en RT-LAMP analyse til påvisning af TiLV i tilapia fisk ved hjælp af enkle instrumenter over en relativt kort periode i forhold til konventionelle RT-PCR teknikker. Denne protokol kan bidrage til at kontrollere den epidemiske spredning af TiLVD, især i udviklingslandene.

Abstract

Tilapia sø virus sygdom (TiLVD), en spirende virussygdom i tilapia forårsaget af tilapia sø virus (TiLV), er en vedvarende udfordring i akvakulturindustrien, der har resulteret i masse sygelighed og dødelighed af tilapia i mange dele af verden. Det er derfor nødvendigt med en effektiv, hurtig og nøjagtig diagnostisk analyse for TiLV-infektion for at påvise den oprindelige infektion og forhindre spredning af sygdommen i akvakulturbrug. I denne undersøgelse, en meget følsom og praktisk omvendt transskription loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-LAMP) metode præsenteres for at opdage tilapia sø virus i fiskevæv. En sammenligning af RT-qPCR- og RT-LAMP-analyserne af inficerede prøver viste positive resultater i 63 (100 %) og 51 (80,95 %) prøver. Desuden viste en analyse af ikke-inficerede prøver, at alle 63 ikke-inficerede væv gav negative resultater for både RT-qPCR- og RT-LAMP-analyserne. Krydsreaktivitet med fem patogener i tilapia blev evalueret ved hjælp af RT-LAMP, og alle test viste negative resultater. Både lever- og slimprøver fra inficerede fisk viste sammenlignelige resultater ved hjælp af RT-LAMP-metoden, hvilket tyder på, at slim kan anvendes i RT-LAMP som en ikke-dødelig analyse for at undgå at dræbe fisk. Resultaterne viste, at den præsenterede RT-LAMP-analyse giver en effektiv metode til TiLV-detektion i tilapiavæv inden for 1 time. Metoden anbefales derfor som screeningsværktøj på bedrifterne med henblik på hurtig diagnosticering af TiLV.

Introduction

Tilapia sø virus sygdom (TiLVD) er en virussygdom i tilapia(Oreochromis spp.), der efter sigende forårsager tilapia dødsfald i mange regioner i verden, herunder Asien1,2,Afrika og Amerika. Sygdommen blev først anerkendt under massedødeligheden af tilapia i 2009 i Israel, hvor antallet af vilde tilapia i Lake Kinneret styrtdykkede dramatisk fra 257 til 8 tons om året2. Sygdommen er forårsaget af tilapia sø virus (TiLV), som er blevet tildelt familien Amnoonviridae som en ny slægt Tilapinevirus og en ny art Tilapia tilapinevirus3. Genetisk karakterisering af TiLV viste, at virussen er en roman indhyllet, negativ-sans, enkeltstrenget RNA-virus, der har 10 segmenter kodning 10 proteiner1,2,4. Forskellige arter af tilapia i slægten Sarotherodon, Oreochromis, og Tilapin og andre varmt vand fisk (f.eks kæmpe gourami (Osphronemus goramy)) har vist sig at være modtagelige for TiLV2,5. I øjeblikket, denne virus fortsætter med at sprede sig globalt, muligvis gennem flytning af inficerede levende fisk6,7, mens risikoen for viral transmission via frosne tilapia eller dens produkt er begrænset8. Betydelig dødelighed som følge af TiLV-infektion har potentiale til at have en betydelig skadelig økonomisk indvirkning på tilapiaindustrien. For eksempel, de økonomiske konsekvenser af sommerdødelighed syndrom i Egypten i forbindelse med TiLV infektion blev beregnet til at være US $ 100 millioner9. Det er derfor vigtigt at udvikle en hurtig og korrekt diagnostisk metode til at lette kontrollen med denne sygdom i dambrug.

Indtil nu har diagnosen TiLVD været baseret på molekylære analyser, viral isolation og histopatologisk. Forskellige PCR protokoller og primere er blevet udviklet til TiLV diagnose10,11. For eksempel, en SYBR grøn-baseret omvendt transskription kvantitative PCR (RT-qPCR) metode med følsomhed til at opdage så få som to kopier / μL af virus er blevet udviklet og valideret for TiLV påvisning10. Andre PCR-metoder til TiLV-registrering omfatter TaqMan quantitative PCR11, RT-PCR2, indlejret RT-PCR12og semi-indlejret RT-PCR13. Disse metoder kræver imidlertid avanceret laboratorieudstyr og relativt længere tid til at give resultater på grund af reaktionernes kompleksitet, hvilket gør dem uegnede til anvendelse i marken.

Den loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP) assay er en hurtig, enkel og praktisk for-felt anvendelse14,15. Teknikken anvender princippet om en streng forskydning reaktion, mens forstærkning reaktion løber under isomale forhold uden en sofistikeret og dyr termisk cycler14,15. Derfor analyseres forstærkede LAMP-produkter eller RT-LAMP-produkter i stigelignende bånd ved hjælp af agarose gel elektroforese med en fluorescerende plet til enten sikker visualisering af DNA eller RNA14 eller observation med det blotte øje for tilstedeværelsen af turbiditet eller en hvid bundfald16,17,18. Denne teknik er derfor blevet anvendt til påvisning på stedet af forskellige fiskepatogener17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Formålet med denne undersøgelse var at etablere en hurtig, følsom og nøjagtig RT-LAMP-analyse til tilvdetektion. RT-LAMP-analysen tilbyder screening for TiLV i fiskeprøver inden for 30 min. Teknikken kan anvendes til diagnosticering og overvågning af TiLVD.

Protocol

Dette eksperiment, som omfattede anvendelse af animalsk væv, blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Kasetsart University, Bangkok, Thailand (protokolnummer ACKU61-VET-009). 1. Vævsindsamling Euthanize tilapia fisk ved hjælp af en overdosis af fed olie (dvs. mere end 3 ml/L). Tricaine methanesulfonat kan bruges som et alternativ til fed olie. Brug steril mayo saks og pincet til at skære åbne maven af postmortem tilapia og punktafgifter ca 30-50 …

Representative Results

I denne undersøgelse blev der udviklet en RT-LAMP-analyse til påvisning af TiLV-infektion i tilapia. De testede prøver blev indsamlet fra 14 gårde i forskellige dele af Thailand mellem 2015 og 2016. De inficerede og ikke-inficerede fisk var primært grupperet baseret på fysiske diagnoser og optrædener af symptomatisk TiLVD. TiLV-infektion blev efterfølgende bekræftet ved hjælp af RT-PCR efter indsamlingsprocessen. Agarose gel elektroforese og påvisning af en selvlysende grøn farve blev valgt som evalueringsmet…

Discussion

Akvakulturindustrien trues konstant af virusinfektioner , der forårsager betydelige økonomiske tab9,23,28. F.eks. udgør den nye TiLV en stor trussel mod tilapiaproducerende lande i mange dele af verden1,6,9. Indtil nu har der ikke været nogen specifik terapeutisk til rådighed for at forhindre TiLVD. Mens udviklingen af en vaccine e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Projektet er finansieret af Thailand Research Fund (TRF) tilskud nummer RDG6050078 og Center for Advanced Studies for Landbrug og Fødevarer, Institut for Avancerede Studier, Kasetsart University, Bangkok, Thailand under Higher Education Research Promotion og National Research University Project of Thailand, Office of the Higher Education Commission, Ministry of Education, Thailand. Forskningen er delvist støttet af Graduate Program Scholarship fra Graduate School, Kasetsart University. Forfatterne vil gerne takke Dr. Kwanrawee Sirikanchana for den fortælling, der taler om videoen og Piyawatchara Sikarin for redigering af videoen.

Materials

Tissue collection:
Clove oil Better Pharma N/A
Tricaine methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 An alternative option to clove oil
RNA extraction:
Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) ThermoFisher Scientific Corp. 15596026
Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) Geneaid GZR100
Direct-zol RNA Kit: Zymo Research R2071
– Direct-zol RNA PreWash
– RNA Wash Buffer
– DNase/RNase-free water
– Zymo-spin IIICG columns
– Collection Tubes
RT-LAMP:
1x SD II reaction buffer Biotechrabbit BR1101301
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich 7487-88-9
dNTP set Bioline BIO-39053
Betaine Sigma-Aldrich B2629
Calcein mixture Merck 1461-15-0
Bst DNA polymerase Biotechrabbit BR1101301
AMV reverse transcriptase Promega M510A
Nuclease-free water Invitrogen 10320995
Elite dry bath incubator, single unit Major Science EL-01-220
Gel electrophoresis:
Agarose Vivantis Technologies PC0701-500G
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer Sigma-Aldrich SRE0062
Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer:
– Tris Vivantis Technologies PR0612-1KG
– Acetic acid (glacial), EMSURE Merck Millipore 1000632500
– Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec Sigma-Aldrich V800170-500G
Neogreen NeoScience Co., Ltd. GR107
DNA gel loading dye (6X) ThermoFisher Scientific Corp. R0611
DNA ladder and markers Vivantis Technologies PC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) Bio-Rad 1704487
PowerPac HC power supply Bio-Rad 1645052
Gel Doc EZ System Bio-Rad 1708270
UV sample tray Bio-Rad 1708271
NαBI imager Neogene Science
cDNA synthesis:
ReverTra Ace qPCR RT Kit Toyobo FSQ-101
Viva cDNA Synthesis Kit Vivantis Technologies cDSK01 An alternative option for cDNA synthesis
NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) ThermoFisher Scientific Corp. ND-2000
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725120
Nuclease-free water, sterile water MultiCell 809-115-CL
8-tube PCR strips, white Bio-Rad TLS0851
Flat PCR tube 8-cap strips, optical Bio-Rad TCS0803
CFX96 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1855196
General equipment and materials:
Mayo scissors N/A
Forceps N/A
Vortex Genie 2 (vortex mixer) Scientific Industries
Microcentrifuge LM-60 LioFuge CM610
Corning LSE mini microcentrifuge Corning 6765
Pipettes Rainin Pipete-Lite XLS
QSP filtered pipette tips Quality Scientific Plastics TF series
Corning Isotip filtered tips Merck CLS series
Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST Wuxi NEST Biotechnology 615601
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
  2. Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
  3. Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
  4. Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
  5. Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
  6. Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , (2017).
  7. Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
  8. Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
  9. Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality’ syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
  10. Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
  11. Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
  12. Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
  13. Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
  14. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
  15. Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
  16. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
  17. Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
  18. Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
  19. Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
  20. Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
  21. Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
  22. Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
  23. Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
  24. Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
  25. Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
  26. Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
  27. Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
  28. Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. 발생학. 121, 255-261 (2005).
  29. Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
  30. Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
  31. Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
  32. Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
  33. Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
  34. Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
  35. Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
  36. Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
  37. Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
  38. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  39. Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).

Tags

Keywords: RT-LAMPReverse Transcription Loop-mediated Isothermal AmplificationTilapia Lake VirusTiLVRapid DetectionRNA ExtractionPrimer DesignPrimerExplorerLAMP PrimersSegment 3AquacultureTilapiaVirus Detection
check_url/kr/61025?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Phusantisampan, T., Rawiwan, P., Roy, S. R. K., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus. J. Vis. Exp. (159), e61025, doi:10.3791/61025 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image