גילוי של גנים הנהג ב המעי הגס HT29-נגזר סרטן גזע כמו Tumorspheres
Summary
הציג כאן הוא פרוטוקול כדי לגלות את הגנים המובעות יתר שמירה על התאים הקבועים גזע הסרטן נגזר מתאי HT29 המעי הגס. RNAseq עם ביואינפורמטיקה זמין בוצע כדי לחקור והמסך רשתות ביטוי גנים להבהיר מנגנון פוטנציאלי מעורב בהישרדות של תאים סרטניים ממוקד.
Abstract
תאים גזע סרטן לשחק תפקיד חיוני נגד טיפולים קליניים, לתרום התדרדרות הגידול. ישנם אונגנים רבים המעורבים בטווריגנזה ובייזום של סגולות סרטן. מאז ביטוי הגנים היווצרות של סרטן המעי הגס, כדורים הנגזרים אינו ברור, זה לוקח זמן כדי לגלות את המנגנון עובד על גן אחד בכל פעם. מחקר זה מדגים שיטה כדי לגלות במהירות את הגנים הנהג מעורב הישרדות של סרטן המעי הגס תאים גזע כמו מבחנה. המעי הגס HT29 תאים סרטניים כי לבטא את LGR5 כאשר מתורבת כמו spheroids וללוות להגדיל CD133 מסמנים שבטנס נבחרו ובשימוש במחקר זה. הפרוטוקול המוצג משמש לביצוע RNAseq עם ביואינפורמטיקה זמין כדי לחשוף במהירות את הגנים מנהל ההתקן בהתהוות של המעי הגס HT29 כדורים נגזר כמו גזע. המתודולוגיה יכולה להקרין במהירות ולגלות גנים פוטנציאליים של מנהלי התקנים במודלים של מחלות אחרות.
Introduction
סרטן המעי הגס (CRC) הוא הגורם המוביל למוות עם שכיחות ותמותה גבוהה ברחבי העולם1,2. בשל מוטציות גנים והגברה, תאים סרטניים לצמוח ללא שליטה מתרבים, אשר תורמת הישרדות התא3, anti-אפופטוזיס4, סרטן שמנת5,6,7. בתוך רקמת הגידול, הגידול טרוגניות מאפשר תאים סרטניים כדי להסתגל ולשרוד במהלך טיפולים טיפוליים8. תאי גזע הסרטן (CSCs), עם שיעור גבוה יותר של חידוש עצמי ו-pluripotency מאשר סוגי סרטן הדיפרנציאלי, הם בעיקר אחראי על הישנות הגידול9,10 ו-CRC גרורות11. CSCs להציג יותר התנגדות סמים12,13,14 ו אנטי אפופטוזיס נכסים15,16, ובכך ששרדו סרטן כימותרפיות.
כאן, על מנת לחקור את המנגנון הפוטנציאלי לסטדיות בתאי הגזע הנבחרים של CRC, RNAseq בוצע למסך באופן מהותי הביע גנים של הגידול בגידולים. התאים הסרטניים יכולים ליצור spheroids (המכונה גם tumorspheres) כאשר גדל בתנאים הקפדה נמוכה מגורה על ידי גורמי גדילה הוסיף למדיום תרבותי, כולל EGF, bFGF, HGF, ו IL6. לכן, בחרנו CRC HT29 תאים סרטניים המתנגדים כימותרפיות עם עלייה ב-STAT3 זרחתי כאשר מטופלים עם oxaliplatin ו irinotecon17. בנוסף, HT29 הביעו סמנים גבוהים יותר כאשר הם מתורבתים בתנאי התרבות המתוארים. HT29-נגזר מודל csc הביע כמויות גבוהות יותר של החזרה leucine-עשיר המכיל G-חלבון מצמידים הקולטן 5 (LGR5)18, סמן מסוים של תאים הגזע CRC19,20. יתר על כן, CD133, נחשב סמנים כלליים לתאי גזע הסרטן, הוא גם מתבטא במידה רבה ב-HT29 cell קו21. המטרה של פרוטוקול זה היא לגלות קבוצות של גנים של מנהלי התקן בסרטן הוקמה כמו גזע tumorspheres מבוסס על הנתונים בביואינפורמטיקה מגדיר לעומת חקירת אונגנים הפרט22. הוא חוקר מנגנונים מולקולריים פוטנציאליים באמצעות ניתוח RNAseq ולאחריו ניתוחים זמינים בביואינפורמטיקה.
רצף הדור הבא הוא התפוקה גבוהה, זמין בקלות, ואמין רצפי DNA שיטה מבוססת על העזרה החישובית, המשמש באופן מקיף גנים מנהלי התקנים עבור הנחיית טיפולים סרטניים23. הטכנולוגיה משמשת גם לגילוי ביטוי גנטי מתוך שעתוק הפוכה של מבודד RNA לדוגמה24. עם זאת, כאשר ההקרנה עם RNAseq, הגנים החשובים ביותר למקד עם טיפול לא יכול להיות הפרש הביטוי הגבוה ביותר בין דגימות ניסוי ובקרה. לכן, כמה ביואינפורמטיקה פותחו לסיווג וזיהוי גנים המבוססים על מערכות נתונים נוכחיות כגון kegg25, GO26,27, או פנתר28, כולל ניתוח מסלול תחכום (IPA)29 ו אנליסט הרשת30. פרוטוקול זה מציג את השילוב של RNAseq ואנליסט הרשת כדי לגלות במהירות קבוצה של גנים בHT29 שנבחרו הנגזרים בהשוואה לתאי HT29 הורים. יישום שיטה זו לדגמי מחלות אחרות מוצע גם לגילוי הבדלים בגנים חשובים.
בהשוואה לחקירה של ביטוי גנים בודדים, טכניקה תפוקה גבוהה מספק יתרונות למצוא גנים פוטנציאליים מנהל התקן בקלות עבור תרופה דיוק הגידול. עם ערכות נתונים שימושיות כגון KEGG, GO, או פנתר, גנים ספציפיים ניתן לזהות מבוסס על דגמי המחלה, מסלולים איתות, או פונקציות ספציפיות, וזה מאפשר במהירות התמקדות בגנים ספציפיים, חשוב, חיסכון בזמן ומחקר עלויות. יישום דומה משמש במחקרים קודמים14,18,31. במיוחד, גידול הוא מסובך יותר, כי סוגים שונים של גידולים לבטא גנים מסלולים להישרדות והתפשטות. לכן, פרוטוקול זה יכול להרים גנים להבחין סוגי גידולים שונים בנסיבות שונות. יש פוטנציאל למצוא אסטרטגיות אפקטיביות נגד סרטן על ידי הבנת המנגנון של ביטוי גנטי ספציפי.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, הסרטן התרבותי כמו גזע מדומה שימשו כמודל בניתוח נתונים RNAseq עם ביואינפורמטיקה זמין. למודל מחלה, נעשה שימוש ב-HT29 הספירות הנגזרות. מכיוון שבספירות הטומוריות יש עמידות בסמים נגד טיפולים סרטניים, המודל הוקם יכול לשמש לחקירת מנגנונים מפורטים של התנגדות על ידי חקירת הבדלים בביטוי הגנים….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לליבה של הביולוגיה הרדיואקטיבית המעבדה למחקר רדיולוגי, בית החולים צ’אנג קונג הזיכרון, לתמיכה טכנית. מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים צ ‘ אנג קונג החולים הזיכרון (CMRPD1J0321), צ’נג Hsin החולים הכללי (CHGH 106-06), ו מקיי החולים הזיכרון (MMH-CT-10605 ו-MMH-106-61). לגופי המימון לא היתה כל השפעה בתכנון המחקר ואיסוף הנתונים, הניתוח והפרשנות של הנתונים או בכתיבת כתב היד.
Materials
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
References
- Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
- Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
- Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509 (2019).
- Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
- Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
- Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
- Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).
- Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).
- Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
- Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
- Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
- Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. 암 연구학. 69 (5), 1951-1957 (2009).
- Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).
- Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
- Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).
- Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).
- Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).
- Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
- Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
- Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).
- Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).
- Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
- Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
- The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
- Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, 377-386 (2013).
- Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
- Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
- Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
