Scoperta dei geni del conducente nelle scansioni tumorali del cancro derivato dal cancro colorettale
Summary
Presentato qui è un protocollo per scoprire i geni del pilota sovraespressi che mantengono le cellule staminali tumorali stabilite derivate dalle cellule del colon-retto HT29. È stato eseguito RNAseq con bioinformatica disponibile per studiare e vagliare le reti di espressione genica per chiarire un potenziale meccanismo coinvolto nella sopravvivenza delle cellule tumorali mirate.
Abstract
Le cellule staminali tumorali svolgono un ruolo vitale contro le terapie cliniche, contribuendo alla ricaduta del tumore. Ci sono molti oncogeni coinvolti nella tumorigenesi e l’avvio delle proprietà dello stelo del cancro. Poiché l’espressione genica nella formazione delle sfere tumorali derivate dal cancro colorettale non è chiara, ci vuole tempo per scoprire i meccanismi che lavorano su un gene alla volta. Questo studio dimostra un metodo per scoprire rapidamente i geni del conducente coinvolti nella sopravvivenza delle cellule staminali del cancro colorettale in vitro. Le cellule tumorali del coloretalizzatore HT29 che esprimono il LGR5 quando coltivate come sferoidi e accompagnano un aumento dei marcatori di stelo CD133 sono state selezionate e utilizzate in questo studio. Il protocollo presentato viene utilizzato per eseguire RNAaseq con bioinformatica disponibile per scoprire rapidamente i geni del pilota sovraespressi nella formazione di sfere tutolali di tipo stelo derivato dall’HT29. La metodologia è in grado di vagliare e scoprire rapidamente potenziali geni del conducente in altri modelli di malattia.
Introduction
Il cancro colorettale (CRC) è una delle principali cause di morte con un’elevata prevalenza e mortalità in tutto il mondo1,2. A causa di mutazioni genetiche e amplificazioni, le cellule tumorali crescono senza controllo proliferativo, che contribuisce alla sopravvivenza cellulare3, anti-apoptosi4e stesità del cancro5,6,7. All’interno di un tessuto tumorale, l’eterogeneità tumorale permette alle cellule tumorali di adattarsi e sopravvivere durante i trattamenti terapeutici8. Le cellule staminali tumorali (CSC), con un più alto tasso di auto-rinnovamento e pluripotenza rispetto ai tipi di cancro differenziale, sono principalmente responsabili della recidiva tumorale9,10 e CRC metastatico11. I CSC presentano più resistenza ai farmaci12,13,14 e proprietà anti-apoptosi15,16, superstiggino così le chemioterapie tumorali.
Qui, al fine di studiare il potenziale meccanismo di stelo nelle cellule staminali CRC selezionate, è stato eseguito RNAseq per vagliare i geni espressi in modo differenziale negli sferoidi tumorali. Le cellule tumorali possono formare sferoidi (chiamati anche sfere tumorali) quando coltivati in condizioni di bassa aderenza e stimolati da fattori di crescita aggiunti al mezzo coltivato, tra cui EGF, bFGF, HGF, e IL6. Pertanto, abbiamo selezionato le cellule tumorali CRC HT29 che resistono alle chemioterapie con un aumento della STAT3 fosforolata quando trattate con oxaliplatin e irinotecon17. Inoltre, HT29 ha espresso marcatori di gambo più elevati quando coltivato nelle condizioni di coltura descritte. Il modello CSC derivato dall’HT29 esprimeva quantità più elevate di recettore G-proteina accoppiato a proteina 5 (LGR5)18,un marcatore specifico delle cellule staminali CRC19,20. Inoltre, CD133, considerato un biomarcatore generale per le cellule staminali tumorali, è anche altamente espresso nella linea cellulare HT2921. Lo scopo di questo protocollo è quello di scoprire gruppi di geni di guida nelle sfere tumorali simili a stelo del cancro stabilite basate su set di dati bioinformatici anziché studiare oncogeni individuali22. Esamina i potenziali meccanismi molecolari attraverso l’analisi degli RNAeq seguita da analisi bioinformatiche disponibili.
Il sequenziamento di nuova generazione è un metodo di sequenziamento del DNA ad alta produttività, facilmente reperibile e affidabile basato su un aiuto computazionale, utilizzato per vagliare in modo completo i geni del conducente per guidare le terapie tumorali23. La tecnologia viene utilizzata anche per rilevare l’espressione genica dalla trascrizione inversa di un campione di RNA isolato24. Tuttavia, durante lo screening con RNAseq, i geni più importanti da rivolgere con la terapia potrebbero non avere il differenziale di espressione più alto tra campioni sperimentali e di controllo. Pertanto, sono state sviluppate alcune bioinformatice per classificare e identificare i geni in base ai set di dati attuali come KEGG25, GO26,27o PANTHER28, tra cui Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 e NetworkAnalyst30. Questo protocollo mostra l’integrazione di RNAseq e NetworkAnalyst per scoprire rapidamente un gruppo di geni negli sferoidi selezionati derivati dall’HT29 rispetto alle cellule parentali HT29. L’applicazione di questo metodo ad altri modelli di malattia è anche suggerita per scoprire le differenze nei geni importanti.
Rispetto allo studio dell’espressione genica individuale, una tecnica ad alto throughput offre vantaggi per trovare facilmente potenziali geni del conducente per la medicina di precisione del tumore. Con set di dati utili come KEGG, GO o PANTHER, geni specifici possono essere identificati sulla base dei modelli di malattia, dei percorsi di segnalazione o di funzioni specifiche, e questo permette di concentrarsi rapidamente su geni specifici e importanti, risparmiando tempo e costi di ricerca. Un’applicazione simile viene utilizzata negli studi precedenti14,18,31. In particolare, un tumore è più complicato perché diversi tipi di tumori esprimono geni distintivi e percorsi per la sopravvivenza e la proliferazione. Pertanto, questo protocollo può raccogliere geni che distinguono diversi tipi di tumore in circostanze diverse. C’è il potenziale per trovare strategie efficaci contro i tumori comprendendo il meccanismo di un’espressione genica specifica.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, le tumori del cancro coltivato sono state utilizzate come modello nell’analisi dei dati degli RNA con la bioinformatica disponibile. Per un modello di malattia, sono state utilizzate sfere tumorali derivate dall’HT29. Poiché le sfere tumorali hanno resistenza ai farmaci contro le terapie tumorali, il modello stabilito può essere utilizzato per studiare i meccanismi dettagliati della resistenza studiando le differenze nell’espressione genica. Inoltre, la tecnologia genomica che utilizza l’RNAseq con la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Radiation Biology Core Laboratory of Institute for Radiological Research, Chang Gung Memorial Hospital, per il supporto tecnico. Questo studio è stato sostenuto dalle sovvenzioni del Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1J0321), del Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06) e del Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 e MMH-106-61). Gli organismi finanziatori non hanno avuto alcuna influenza nella progettazione dello studio e nella raccolta, analisi e interpretazione dei dati o nella scrittura del manoscritto.
Materials
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
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