HT29由来癌幹細胞様腫瘍球におけるドライバ遺伝子の発見
Summary
ここで提示される、大腸HT29細胞由来の確立された癌幹細胞様細胞を維持する過剰発現ドライバ遺伝子を発見するためのプロトコルである。RNAAseqは、標的腫瘍細胞の生存に関与する潜在的なメカニズムを解明するための遺伝子発現網を調査およびスクリーニングするために実施した。
Abstract
がん幹細胞は臨床療法に対して重要な役割を果たし、腫瘍の再発に寄与する。腫瘍形成と癌幹細胞性の開始に関与する多くの腫瘍遺伝子があります。大腸癌由来腫瘍球の形成における遺伝子発現は不明であるため、一度に1つの遺伝子に作用するメカニズムを発見するのに時間がかかる。本研究は、インビトロで大腸癌幹細胞様細胞の生存に関与するドライバ遺伝子を迅速に発見する方法を示す。スフェロイドとして培養し、増加したCD133ステムネスマーカーに伴うLGR5を発現する大腸HT29癌細胞を選択し、本研究で使用した。提示されるプロトコルは、大腸HT29由来の茎様腫瘍球の形成における過剰発現ドライバー遺伝子を迅速に明らかにするために、利用可能なバイオインフォマティクスを用いてRNAseqを実行するために使用される。方法論は、他の疾患モデルの潜在的なドライバー遺伝子を迅速にスクリーニングし、発見することができます。
Introduction
大腸癌(CRC)は、世界的に高い罹患率と死亡率を有する主要な死因である1,,2。遺伝子変異や増幅のために、癌細胞は増殖制御なしで増殖し、細胞生存に寄与する3、抗アポトーシス4、及び癌幹細胞5、6、7。6,75腫瘍組織内では、腫瘍の不均一性により、腫瘍細胞は治療治療中に適応し、生き残ることができる8.癌幹細胞(CSC)は、形切れ癌タイプよりも自己再生率および多能性の割合が高く、主に腫瘍再発99、10および10転移性CRC11を担う。CSCは、より多くの薬剤耐性12、13、1413,14および抗アポトーシス特性15、16を提示し、16したがって腫瘍化学療法を生き残る。12
ここで、選択したCRC幹細胞における幹細胞の潜在的な機構を調べるため、RNAseqは腫瘍スフェロイド中の微分発現遺伝子をスクリーニングするために行った。癌細胞は、低い付着条件で増殖し、EGF、bFGF、HGF、およびIL6を含む培養培地に添加された成長因子によって刺激されたときにスフェロイド(腫瘍球とも呼ばれる)を形成することができる。そこで、オキサリプラチンとイリノテコン17で処理した場合にリン酸化STAT3の増加に伴う化学療法に抵抗するCRC HT29腫瘍細胞を選択した。また、HT29は、記載した培養条件で培養した場合に、より高いステムマーカーを発現した。HT29由来のCSCモデルは、より多量のロイシンを含む反復含有Gタンパク質共役受容体5(LGR5)18を発現し、CRC幹細胞1819,20,20の特異的マーカーである。また、CD133は、がん幹細胞の一般的なバイオマーカーと考えられ、HT29細胞株21においても高発現している。このプロトコルの目的は、個々の腫瘍遺伝子22を調査するのではなく、バイオインフォマティクスデータセットに基づいて確立された癌幹様腫瘍球中のドライバ遺伝子群を発見することである。RNAseq分析を通じて潜在的な分子メカニズムを調べ、その後、利用可能なバイオインフォマティクス分析を行います。
次世代シーケンシングは、高スループット、容易に入手でき、かつ、計算助けに基づく信頼性の高いDNAシーケンシング法であり、腫瘍療法23を導くためにドライバ遺伝子を包括的にスクリーニングするために使用される。この技術は、単離されたRNAサンプル24の逆転写から遺伝子発現を検出するためにも使用される。しかし、RNAseqでスクリーニングする場合、治療を標的とする最も重要な遺伝子は、実験サンプルと対照サンプルの間で最も高い発現差を有しない可能性がある。したがって、いくつかのバイオインフォマティクスは、創意工夫経路解析(IPA)29およびNetworkAnalyst30を含むKEGG29 25、GO26、27、,27またはPanther28などの現在のデータセットに基づいて遺伝子を分類し、同定するために開発された。このプロトコルは、RNAAseqとNetworkAnalystの統合を示し、親のHT29細胞と比較して、選択したHT29由来のスフェロイドの遺伝子群を素早く発見します。この方法を他の疾患モデルに適用することは、重要な遺伝子の違いを発見するためにも示唆される。
個々の遺伝子発現の調査と比較して、ハイスループット技術は、腫瘍精密医療のための潜在的なドライバー遺伝子を容易に見つける利点を提供します。KEGG、GO、パンサーなどの有用なデータセットを使用すると、疾患モデル、シグナル伝達経路、または特定の機能に基づいて特定の遺伝子を同定することができ、これにより特定の重要な遺伝子に迅速に焦点を当て、時間と研究コストを節約できます。同様のアプリケーションは、以前の研究で使用されています,14,18,,31.特に、腫瘍の種類が異なるため、腫瘍は生存および増殖のための遺伝子と経路を区別する発現するので、より複雑である。したがって、このプロトコルは、異なる状況下で異なる腫瘍タイプを区別する遺伝子を拾うことができる。特定の遺伝子発現のメカニズムを理解することで、がんに対する効果的な戦略を見つける可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、培養された癌幹細胞様腫瘍球を、利用可能なバイオインフォマティクスを用いてRNAEqデータを解析するモデルとして用いた。疾患モデルでは、HT29由来の腫瘍球が使用された。腫瘍球は腫瘍療法に対する薬剤耐性を有するため、遺伝子発現の違いを調べ、耐性の詳細なメカニズムを調べることができる。さらに、RNAseqを利用したゲノム技術は、研究モデルを迅速に理解し、潜在的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、チャン・グン記念病院放射線研究所放射線生物学コア研究所に技術支援を感謝する。この研究は、チャン・グン記念病院(CMRPD1J0321)、チェンシン総合病院(CHGH 106-06)、マッカイ記念病院(MMH-CT-10605およびMMH-106-61)からの助成金によって支えられました。資金調達機関は、研究の設計やデータ収集、データの分析と解釈、または原稿の執筆に影響を与えませんでした。
Materials
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
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