Открытие гена водителя в колоректальных HT29-производных рака стволовых как опухоли
Summary
Представленный здесь протокол, чтобы обнаружить переэкспрессированных генов водителя поддержания установленных раковых стволовых клеток, полученных из колоректальных клеток HT29. RNAseq с имеющейся биоинформатикой была выполнена для того чтобы исследовать и экранировать сети выражения гена для обуздывать потенциальный механизм, котор включили в выживание пристрелных тучные клетки.
Abstract
Раковые стволовые клетки играют жизненно важную роль против клинической терапии, способствуя рецидиву опухоли. Есть много онкогенов, участвующих в опухолевом мизахигене и инициировании свойств стволовой протежения рака. Поскольку экспрессия генов при формировании опухолевых опухолей, полученных из колоректального рака, неясна, требуется время, чтобы обнаружить механизмы, работающие на одном гене за раз. Это исследование демонстрирует метод, чтобы быстро обнаружить гены водителя, участвующих в выживании колоректального рака стволовых клеток в пробирке. Колоректальные раковые клетки HT29, которые выражают LGR5, когда культивируется как сфероиды и сопровождают увеличение CD133 маркеры стволовой стали были выбраны и использованы в этом исследовании. Представленный протокол используется для выполнения RNAseq с имеющейся биоинформатикой, чтобы быстро выявить переэкспрессированные гены драйвера при формировании колоректальных HT29-производных стволовых туморфер. Методология может быстро проверять и открывать потенциальные гены водителя в других моделях болезней.
Introduction
Колоректальный рак (CRC) является ведущей причиной смерти с высокой распространенностью и смертностью во всем мире1,2. Благодаря генным мутациям и усилениям раковые клетки растут без пролиферативного контроля, что способствует выживанию клеток3,антиапоптозу4,а раковая стволовая прослудания5,,6,7. В опухолевой ткани, неоднородность опухоли позволяет опухолевым клеткам адаптироваться и выжить во время терапевтического лечения8. Раковые стволовые клетки (CSCs), с более высоким уровнем самообновления и плюрипотентности, чем дифференциальные типы рака, в основном ответственны за рецидив опухоли9,,10 и метастатический CRC11. CSCs представить больше лекарственной устойчивости12,13,14 и анти-апоптоза свойства15,16, таким образом, выживших опухолевых химиотерапий.
Здесь, для того, чтобы исследовать потенциальный механизм для стволовой протеченности в выбранных стволовых клетках CRC, RNAseq был выполнен для проверки дифференциально выраженных генов в опухолевых сфероидах. Раковые клетки могут образовывать сфероиды (также называемые опухолевымисферами) при выращивании в условиях низкой приверженности и стимулируемые факторами роста, добавленными в культивируемую среду, включая EGF, bFGF, HGF и IL6. Поэтому мы выбрали опухолевые клетки CRC HT29, которые сопротивляются химиотерапии с увеличением фосфорилированного STAT3 при лечении оксалиплатином и иринотеконом17. Кроме того, HT29 выразил более высокие маркеры стволовой связи при культуре в описанных условиях культуры. HT29-производные CSC модель выразила более высокое количество лейцин богатых повторносодержащих G-белков связанных рецепторов 5 (LGR5)18, конкретный маркер стволовых клеток CRC19,20. Кроме того, CD133, считается общим биомаркером для раковых стволовых клеток, также высоко выражен в HT29 клеточной линии21. Цель этого протокола состоит в том, чтобы обнаружить группы генов водителя в установленных стволовых опухолей, как рак на основе биоинформатики наборы данных, в отличие от исследования отдельных онкогенов22. Он исследует потенциальные молекулярные механизмы с помощью анализа RNAseq с последующим доступным биоинформатикой анализов.
Следующее поколение секвенирования является высокой пропускной способностью, легко доступны, и надежный метод секвенирования ДНК на основе вычислительной помощи, используется для всестороннего анализа генов водителя для руководящих опухоли терапии23. Технология также используется для обнаружения экспрессии генов при обратной транскрипции изолированного образца РНК24. Однако, при скрининге с RNAseq, наиболее важные гены для целевой с терапией не может иметь самый высокий дифференциал выражения между экспериментальными и контрольными образцами. Таким образом, некоторые биоинформатики были разработаны для классификации и идентификации генов на основе текущих наборов данных, таких как KEGG25, GO26,27, или PANTHER28, в том числе изобретательность Путь анализа (IPA)29 и NetworkAnalyst30. Этот протокол показывает интеграцию RNAseq и NetworkAnalyst быстро обнаружить группу генов в выбранных HT29 полученных сфероидов по сравнению с родительскими клетками HT29. Применение этого метода к другим моделям болезней также предлагается для выявления различий в важных генах.
По сравнению с исследованием индивидуального экспрессии генов, высокопроизводительная техника обеспечивает преимущества для легкого поиска потенциальных генов водителя для медицины точности опухоли. С помощью полезных наборов данных, таких как KEGG, GO или PANTHER, конкретные гены могут быть определены на основе моделей болезней, сигнальных путей или конкретных функций, что позволяет быстро сосредоточиться на конкретных, важных генах, экономя время и затраты на исследования. Аналогичное применение используется в предыдущих исследованиях14,,18,31. В частности, опухоль является более сложным, поскольку различные типы опухолей выражают отличительные гены и пути для выживания и распространения. Таким образом, этот протокол может подобрать гены, отличающие различные типы опухолей при различных обстоятельствах. Существует потенциал, чтобы найти эффективные стратегии борьбы с раком, понимая механизм конкретного экспрессии генов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании, культивируемые рака стволовых, как опухоли были использованы в качестве модели в анализе данных RNAseq с имеющимися биоинформатики. Для модели болезни были использованы опухолевые сферы HT29. Поскольку опухолевые области имеют лекарственную устойчивость к терапии опу…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят базовую лабораторию радиационной биологии Института радиологических исследований Чанг Гуна за техническую поддержку. Это исследование было поддержано грантами от Чанг Гун Мемориал больницы (CMRPD1J0321), Чэн Синь больницы (CHGH 106-06), и Маккей Мемориальный госпиталь (MMH-CT-10605 и MMH-106-61). Финансируемые органы не имели никакого влияния на разработку исследования и сбора данных, анализа и интерпретации данных или на написание рукописи.
Materials
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
References
- Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
- Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
- Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509 (2019).
- Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
- Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
- Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
- Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).
- Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).
- Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
- Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
- Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
- Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. 암 연구학. 69 (5), 1951-1957 (2009).
- Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).
- Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
- Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).
- Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).
- Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).
- Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
- Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
- Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).
- Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).
- Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
- Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
- The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
- Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, 377-386 (2013).
- Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
- Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
- Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
