Ontdekking van drivergenen in colorectale HT29-afgeleide kankerstam-achtige tumorsferen
Summary
Hier gepresenteerd is een protocol om de overuitexpressieve driver genen behoud van de gevestigde kanker stam-achtige cellen afgeleid van colorectale HT29 cellen te ontdekken. RNAseq met beschikbare bioinformatica werd uitgevoerd om genexpressienetwerken te onderzoeken en te screenen voor het ophelderen van een potentieel mechanisme dat betrokken is bij de overleving van gerichte tumorcellen.
Abstract
Kanker stamcellen spelen een vitale rol tegen klinische therapieën, bij te dragen aan tumor terugval. Er zijn veel oncogenes betrokken bij tumorigenese en de initiatie van kanker stamheid eigenschappen. Aangezien genexpressie in de vorming van colorectale kanker-afgeleide tumorsferen onduidelijk is, kost het tijd om de mechanismen te ontdekken die aan één gen tegelijk werken. Deze studie toont een methode om snel te ontdekken van de bestuurder genen die betrokken zijn bij de overleving van de colorectale kanker stam-achtige cellen in vitro. Colorectale HT29 kankercellen die de LGR5 uitdrukken wanneer gekweekt als sferoïden en begeleiden een toename CD133 stemness markers werden geselecteerd en gebruikt in deze studie. Het gepresenteerde protocol wordt gebruikt om RNAseq uit te voeren met beschikbare bioinformatica om snel de overuitexpressiebestuurdersgenen te ontdekken in de vorming van colorectale HT29-afgeleide stamachtige tumorsferen. De methodologie kan snel potentiële bestuurdersgenen in andere ziektemodellen screenen en ontdekken.
Introduction
Colorectale kanker (CRC) is een belangrijke doodsoorzaak met een hoge prevalentie en sterfte wereldwijd1,2. Als gevolg van genmutaties en versterkingen groeien kankercellen zonder proliferative controle, wat bijdraagt aan celoverleving3, anti-apoptose4en kankerstamness5,6,7. Binnen een tumorweefsel, tumor heterogeniteit kan tumorcellen aan te passen en te overleven tijdens therapeutische behandelingen8. Kankerstamcellen (CSC’s), met een hoger percentage zelfvernieuwing en pluripotentie dan differentiële kankertypes, zijn voornamelijk verantwoordelijk voor tumorrecidief9,10 en gemetastasatied CRC11. CSC’s presenteren meer resistentie tegen geneesmiddelen12,13,14 en anti-apoptose eigenschappen15,16, dus overleven tumor chemotherapieën.
Hier, om het potentiële mechanisme voor stamheid in de geselecteerde CRC stamcellen te onderzoeken, werd RNAseq uitgevoerd om differentieel uitgedrukte genen in tumorsferoïden te screenen. De kankercellen kunnen sferoïden (ook wel tumorsferen) vormen wanneer ze worden gekweekt in lage therapietrouw en gestimuleerd door groeifactoren die zijn toegevoegd aan het gekweekte medium, waaronder EGF, bFGF, HGF en IL6. Daarom hebben we crc HT29-tumorcellen geselecteerd die bestand zijn tegen chemotherapieën met een toename van fosforyleerde STAT3 wanneer ze worden behandeld met oxaliplatine en irinotecon17. Bovendien, HT29 uitgedrukt hogere stemness markers wanneer gekweekt in de beschreven cultuur voorwaarden. Het HT29-afgeleide CSC-model gaf hogere hoeveelheden leucine-rijke repeat-containing G-eiwit gekoppelde receptor 5 (LGR5)18, een specifieke marker van CRC stamcellen19,20. Bovendien wordt CD133, beschouwd als een algemene biomarker voor kankerstamcellen , ook zeer uitgedrukt in de HT29-cellijn21. Dit protocol doel is om groepen van de bestuurder genen te ontdekken in de gevestigde kanker stam-achtige tumorsferen op basis van bio-informatica datasets in tegenstelling tot het onderzoeken van individuele oncogenen22. Het onderzoekt potentiële moleculaire mechanismen door middel van RNAseq-analyse, gevolgd door beschikbare bioinformatica-analyses.
De volgende generatie sequencing is een high-throughput, gemakkelijk beschikbaar, en betrouwbare DNA-sequencing methode op basis van computationele hulp, gebruikt om volledig te screenen driver genen voor het begeleiden van tumor therapieën23. De technologie wordt ook gebruikt voor het detecteren van genexpressie van omgekeerde transcriptie van een geïsoleerd RNA-monster24. Echter, bij het screenen met RNAseq, de belangrijkste genen te richten met therapie kan niet de hoogste expressie differentieel tussen experimentele en controle monsters. Daarom zijn sommige bioinformatica ontwikkeld voor het classificeren en identificeren van genen op basis van actuele datasets zoals KEGG25, GO26,27of PANTHER28, waaronder Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 en NetworkAnalyst30. Dit protocol toont de integratie van RNAseq en NetworkAnalyst om snel een groep genen te ontdekken in de geselecteerde HT29-afgeleide sferoïden in vergelijking met ouderlijke HT29-cellen. Toepassing van deze methode op andere ziektemodellen wordt ook voorgesteld voor het ontdekken van verschillen in belangrijke genen.
Vergeleken met onderzoek van individuele genexpressie biedt een hoge doorvoertechniek voordelen om gemakkelijk potentiële bestuurdersgenen te vinden voor tumorprecisiegeneeskunde. Met nuttige datasets zoals KEGG, GO of PANTHER kunnen specifieke genen worden geïdentificeerd op basis van de ziektemodellen, signaleringstrajecten of specifieke functies, en dit maakt het mogelijk om snel te focussen op specifieke, belangrijke genen, wat tijd en onderzoekskosten bespaart. Een soortgelijke toepassing wordt gebruikt in eerdere studies14,18,31. In het bijzonder, een tumor is ingewikkelder omdat verschillende soorten tumoren uitdrukken onderscheidende genen en paden voor overleving en proliferatie. Daarom kan dit protocol genen oppikken die verschillende tumortypen onder verschillende omstandigheden onderscheiden. Er is het potentieel om effectieve strategieën tegen kanker te vinden door het mechanisme van specifieke genexpressie te begrijpen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie werden gekweekte kankerstamachtige tumorsferen gebruikt als model bij het analyseren van RNAseq-gegevens met beschikbare bioinformatica. Voor een ziektemodel werden HT29-afgeleide tumorsferen gebruikt. Omdat de tumorsferen resistentie tegen tumortherapieën hebben, kan het gevestigde model worden gebruikt om de gedetailleerde mechanismen van resistentie te onderzoeken door verschillen in genexpressie te onderzoeken. Bovendien biedt genomische technologie met RNAseq met beschikbare bioinformatica een snel i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken het Radiation Biology Core Laboratory of Institute for Radiological Research, Chang Gung Memorial Hospital, voor technische ondersteuning. Deze studie werd ondersteund door subsidies van Chang Gung Memorial ziekenhuis (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06), en Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 en MMH-106-61). Financieringsorganen hadden geen invloed op het ontwerp van de studie en het verzamelen van gegevens, analyse en interpretatie van gegevens of bij het schrijven van het manuscript.
Materials
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
References
- Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
- Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
- Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509 (2019).
- Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
- Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
- Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
- Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).
- Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).
- Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
- Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
- Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
- Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. 암 연구학. 69 (5), 1951-1957 (2009).
- Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).
- Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
- Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).
- Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).
- Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).
- Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
- Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
- Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).
- Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).
- Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
- Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
- The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
- Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, 377-386 (2013).
- Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
- Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
- Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
