Bruke magnetometry til å overvåke cellulær inkorporering og påfølgende biologisk nedbrytning av kjemisk synthetiserte jernoksid nanopartikler

Summary

Jernoksid nanopartikler syntetiseres via en ikke-vandig sol gel prosedyre og belagt med anioniske korte molekyler eller polymer. Bruk av magnetometry for overvåking av inkorporering og biotransformasjoner av magnetiske nanopartikler inne i menneskelige stamceller er demonstrert ved hjelp av et vibrerende prøvemagnetometer (VSM).

Abstract

Magnetiske nanopartikler, laget av jernoksid, presenterer en særegen interesse for et bredt spekter av biomedisinske applikasjoner som de ofte internaliseres i celler og deretter igjen innenfor. En utfordring er å vurdere deres skjebne i det intracellulære miljøet med pålitelige og presise metoder. Her introduserer vi bruken av det vibrerende prøvemagnetometeret (VSM) for å nøyaktig kvantifisere integriteten til magnetiske nanopartikler i celler ved å måle deres magnetiske øyeblikk. Stamceller er først merket med to typer magnetiske nanopartikler; nanopartiklene har samme kjerne produsert via en rask og effektiv mikrobølgebasert ikke-vandig solgelsyntese og varierer i belegget: det vanlige sitronsyremolekylet sammenlignes med polyakrylsyre. Dannelsen av 3D-celle-sfæroider oppnås deretter via sentrifugering, og det magnetiske øyeblikket til disse sfæroidene måles til forskjellige tider med VSM. Det oppnådde øyeblikket er et direkte fingeravtrykk av nanopartiklenes integritet, med avtagende verdier som indikerer en nanopartikkelforringelse. For begge nanopartikler reduseres det magnetiske øyeblikket over kulturtid som avslører deres biologisk nedbrytning. En beskyttende effekt av polyakrylsyrebelegget er også vist, sammenlignet med sitronsyre.

Introduction

Det er økt interesse for de magnetiske egenskapene til jernoksid nanopartikler for et bredt spekter av biomedisinske applikasjoner. Deres respons på magnetisk resonans gjør dem pålitelige kontrastmidler for magnetisk resonansavbildning (MR), en fordel i regenerativ medisin hvor celler merket med magnetiske nanopartikler kan spores in vivo etter implantasjon¹. Ved hjelp av magnetiske felt kan celler også styres på avstand; på denne måten kan cellulære^{sfæroider 2},³,^{ringer 4}eller^{ark 5} konstrueres magnetisk og også eksternt stimulert⁶, en ressurs i utviklingen av stillasfritt vev. Utvalget av muligheter for disse nanopartikler inkluderer også legemiddelleveringssystemer^7,8 og magnetisk og fotoindusert hypertermisk behandling for å drepe kreftceller^9,10,11. For alle disse programmene er nanopartiklene integrert i det biologiske miljøet enten ved intravenøs injeksjon eller via direkte internalisering i celler og blir deretter igjen innenfor, noe som bringer inn spørsmålet deres intracellulære skjebne.

In vivo analyser formidlet en generell forståelse av nanopartikler skjebne i organismen: ved injeksjon i blodet, blir de først fanget hovedsakelig av makrofagene i leveren (Kupffer celler), milt og benmarg, blir gradvis degradert, og bli med jern bassenget av organismen^{12,13,14,15,16,17,18,19}. Kvalitative observasjoner er bare mulig på grunn av sirkulasjonen av nanopartiklene i hele organismen. Vanligvis kan overføring elektronisk mikroskopi (TEM) brukes til å observere nanopartiklene direkte, og tilstedeværelsen av jern i organene kan bestemmes via dosering. Mer nylig har deres skjebne blitt vurdert direkte på en pool av celler, noe som betyr i nær krets uten jernflukt, slik at en kvantitativ måling av deres biotransformasjoner på cellenivå^20,21,22. Slike målinger er mulige via analysen av nanopartiklenes magnetiske egenskaper som er tett knyttet til deres strukturelle integritet. Vibrerende prøvemagnetometri (VSM) er en teknikk der prøven vibreres med jevne mellomrom, slik at spolemålingen av fluksindusert gir det magnetiske øyeblikket til prøven på det påførte magnetfeltet. Slik synkron deteksjon gir mulighet for en rask måling, som er en ressurs for å bestemme de magnetiske øyeblikkene til et stort antall^{prøver 20,21,22,23}. Den makroskopiske magnetiske signaturen hentet av VSM gir deretter en kvantitativ oversikt over hele den biologiske prøven som er direkte korrelert med nanopartiklenes størrelse og struktur. Spesielt gir det magnetiske øyeblikket ved metning (uttrykt i emu) av prøvene, som er en direkte kvantifisering av antall magnetiske nanopartikler tilstede i prøven, henholdsvis til deres spesifikke magnetiske egenskaper.

Det har vist seg at den intracellulære behandlingen av magnetiske nanopartikler er tett knyttet til deres strukturelle egenskaper²⁰. Disse funksjonene kan styres via optimale synteseprotokoller. Hver protokoll gir fordeler og begrensninger. Jernoksid nanopartikler er ofte syntetisert i vandige løsninger via coprecipitation av jernioner²⁴. For å overvinne begrensningene av nanopartikler størrelse polydispersity, andre syntese metoder som polyol-mediert sol-gel metoder har blitt utviklet²⁵. Ikke-queous tilnærminger ved termisk nedbrytning fører til produksjon av svært godt kalibrert jernoksid nanopartikler²⁶. Imidlertid kompliserer bruken av massive mengder overflateaktive stoffer som oleylamin eller oljesyre deres funksjonalisering og vannoverføring for biomedisinske applikasjoner. Av denne grunn syntetiserer vi slike magnetiske nanopartikler gjennom en ikke-vandig solgelrute som fører til høy krystallinitet, renhet og reproduserbarhet²⁷. Denne protokollen produserer velstyrte nanopartikler i størrelse som kan justeres gjennom temperaturvariasjon²⁸. Likevel har den mikrobølgeassisterte ikke-vandige sol-gelruten en øvre størrelsesgrense på de oppnådde nanopartikler på rundt 12 nm. Denne prosedyren ville ikke bli tilpasset for applikasjoner ved hjelp av ferromagnetiske partikler ved romtemperatur. I tillegg til kjernen syntese, en annen hovedfunksjon som skal vurderes er belegget. Liggende på overflaten av nanopartikkelen fungerer belegget som et forankringsmolekyl, og hjelper den målrettede internaliseringen av nanopartiklene, eller det kan beskytte nanopartikkelen mot nedbrytning. Siden benzylalkohol fungerer som oksygenkilde og en ligand samtidig, produseres nakne nanopartikler uten behov for ekstra overflateaktive stoffer eller ligander. Nanopartiklene blir deretter lett overflatefunksjonalisert etter syntese uten en overflateaktivt utvekslingsprosess.

Heri vurderes to typer nanopartikler som har samme kjerne og varierer i belegget. Kjernen syntetiseres ved hjelp av en rask og svært effektiv mikrobølgebasert teknikk. De to beleggene sammenlignet består av sitronsyre, en av de mest brukte som belegg i biomedisinske applikasjoner^29,30,og polyakrylsyre (PAA), et polymerbelegg med et høyt antall chelating funksjoner. VSM magnetometrimålinger brukes deretter først til å kvantifisere nanopartikkelopptaket av cellene, og deretter som en direkte vurdering av nanopartikkelens strukturelle integritet ved internalisering i stamceller. Resultatene viser at inkubasjonskonsentrasjonen påvirker nanopartikkelopptaket og at belegget påvirker deres nedbrytning, med det store antallet forankringsmolekyler av PAA som beskytter kjernen mot nedbrytning.

Protocol

1. Syntese av magnetiske nanopartikler Kjernesyntese – mikrobølgeassistert Oppløs 400 mg jern (III) acetylacetonat (> 99,9%) i 10 ml benzylalkohol (BA, 99,8 %) i et 30 ml hetteglass med monobølgeglass. Øk temperaturen på suspensjonen fra 25 til 250 °C i 20 min (med en hastighet på 11,25 °C/min) og vedlikehold den ved 250 °C i 30 min ved hjelp av en mikrobølgeovnreaktor. Overfør de resulterende nanopartikler suspendert i benzylalkohol til et hetteglass med glass og skil…

Representative Results

Ved hjelp av mikrobølgeassistert syntese produseres magnetiske nanopartikler med monodisperse 8,8 ± 2,5 nm kjernestørrelse og belagt med enten citrate eller PAA (figur 1A). Stamceller inkuberes deretter med disse nanopartikler dispergert i kulturmedium ved en gitt konsentrasjon i 30 minutter, noe som resulterer i endocytose og innesperring i cellulære endosomer (figur 1B). De magnetiske stamcellene blir deretter suspendert i middels, sentrifugert, og cellepe…

Discussion

Ved hjelp av en rask og effektiv mikrobølgebasert syntese kan magnetiske nanopartikler enkelt syntetiseres, med kontrollert størrelse og ytterligere belagt med gitte molekyler. Et kritisk skritt er å lagre jernsaltet og benzylalkoholen under vakuum for å holde en liten spredning i størrelse. Benzylalkoholen fungerer som både løsemiddel og ligand samtidig slik at den direkte kan få kalibrert bart jernoksid uten behov for ekstra ligander. Etter nanopartikler overføres i vann kan de nakne magnetiske nanopartiklene …

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Benzyl alcohol for synthesis	Sigma Aldrich	8.22259
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C
Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR	VWR Chemicals	23367
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-106
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35640
Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%)	Sigma Aldrich	517003
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501
Monowave glass vial	Anton Paar	82723_us
Microwave reactor	Anton Paar	Monowave 300
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL)	Life Technologies	15140-122
Poly(acrylic acid, sodium salt)	Sigma Aldrich	416010	MW = 1200 g/mol
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35629
Sodium pyruvate solution 100mM	Sigma	S8636
Sterile conical centrifuge tube	Falcon	352097	15 mL tubes
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis	Sigma Aldrich	10396430
Ultra centrifugal filter	Amicon	AC S510024