Использование магнитометрии для мониторинга клеточной инкорпорации и последующей биодеградации химически синтезированных наночастиц оксида железа
Summary
Наночастицы оксида железа синтезируются с помощью неакеозной процедуры геля sol и покрываются анионическими короткими молекулами или полимером. Использование магнитометрии для мониторинга включения и биотрансформации магнитных наночастиц внутри стволовых клеток человека демонстрируется с помощью вибрирующего образца магнитометра (VSM).
Abstract
Магнитные наночастицы, сделанные из оксида железа, представляют особый интерес для широкого спектра биомедицинских применений, для которых они часто интернализированы в клетках, а затем оставлены внутри. Одна из задач заключается в оценке их судьбы во внутриклеточной среде с помощью надежных и точных методологий. В этом случае мы вводим использование вибрирующего образца магнитометра (VSM) для точной количественной оценки целостности магнитных наночастиц в клетках путем измерения их магнитного момента. Стволовые клетки сначала помечены двумя типами магнитных наночастиц; наночастицы имеют то же ядро производится через быстрый и эффективный микроволновой основе неакеозного синтеза сол гель и отличаются по своему покрытию: широко используется молекула лимонной кислоты по сравнению с полиакриновой кислоты. Формирование 3D-сфероидов достигается с помощью центрифугации и магнитный момент этих сфероидов измеряется в разное время с ПОМОЩЬю VSM. Полученный момент является прямым отпечатком пальца целостности наночастиц, с уменьшением значений, указывающих на деградацию наночастиц. Для обоих наночастиц, магнитный момент уменьшается с течением времени культуры выявление их биодеградации. Защитный эффект полиакрилиновой кислоты покрытие также показано, по сравнению с лимонной кислоты.
Introduction
Существует повышенный интерес к магнитным особенностям наночастиц оксида железа для широкого спектра биомедицинских применений. Их реакция на магнитный резонанс делает их надежными контрастными агентами для магнитно-резонансной томографии (МРТ), преимущество в регенеративной медицине, где клетки, помеченные магнитными наночастицами, могут быть отслежены in vivoпосле имплантации 1. Используя магнитные поля, клетки также могут быть направлены на расстоянии; Таким образом, клеточныесфероиды 2,3,кольца 4, илилисты 5 могут быть разработаны магнитно, а также удаленностимулировали 6, актив в развитии эшафот-свободных тканей. Диапазон возможностей для этих наночастиц также включает в себя системыдоставки лекарств 7,8 и магнитного и фотоиндицированных гипертермальноголечения, чтобы убить раковые клетки 9,10,11. Для всех этих применений наночастицы интегрируются в биологическую среду либо путем внутривенных инъекций, либо путем прямой интернализации клеток, а затем остаются внутри, что ставит под сомнение их внутриклеточную судьбу.
Анализы In vivo передают общее понимание судьбы наночастиц в организме: при инъекциях в кровоток они впервые захвачены в основном макрофагами печени (клетки Купфера), селезенкой и костным мозгом, постепенно деградируют, и присоединяютсяк железному бассейну организма 12,13,14,15,16,17,18,19. Качественные наблюдения возможны только благодаря циркуляции наночастиц по всему организму. Как правило, передача электронной микроскопии (TEM) может быть использована для непосредственного наблюдения за наночастицами и наличие железа в органах может быть определено через дозировку. Совсем недавно, их судьба была оценена непосредственно на пул клеток, то есть в тесной цепи без железного побега, что позволяет количественное измерение их биотрансформациина клеточном уровне 20,21,22. Такие измерения возможны с помощью анализа магнитных свойств наночастиц, которые тесно связаны с их структурной целостностью. Вибрирующий образец магнитометрии (VSM) является методом, где образец периодически вибрирует так, что катушка-измерение потока индуцированных обеспечивает магнитный момент образца на прикладном магнитном поле. Такое синхронное обнаружение позволяет быстро измерять, что является активом для определения магнитных моментов большого количестваобразцов 20,21,22,23. Макроскопическая магнитная подпись, полученная VSM, дает количественный обзор всего биологического образца, непосредственно связанного с размером и структурой наночастиц. В частности, он обеспечивает магнитный момент насыщения (выраженный в эму) образцов, что является прямой количественной оценкой количества магнитных наночастиц, присутствующих в образце, соответственно их специфическим магнитным свойствам.
Было показано, что внутриклеточная обработка магнитных наночастиц тесно связана с их структурными особенностями20. Эти функции можно контролировать с помощью оптимальных протоколов синтеза. Каждый протокол предоставляет преимущества и ограничения. Наночастицы оксида железа обычно синтезируются в акальных растворах с помощью совокупления ионовжелеза 24. Для преодоления ограничений полидисперсности размеров наночастиц были разработаны другие методы синтеза, такие как методы полиол-опосредованногосол-геля. Неакеальные подходы при термической разложении приводят к выработке очень хорошо откалиброванных наночастицоксида железа 26. Тем не менее, использование огромного количества сурфактантов, таких как олейламин или олеиновая кислота, усложняет их функционализацию и передачу воды для биомедицинских применений. По этой причине, мы синтезируем такие магнитные наночастицы через неакеозный маршрут сол гель, ведущий к высокой кристалличность, чистота и воспроизводимость27. Этот протокол производит хорошо контролируемые наночастицы размера, которые могут быть настроены через изменение температуры28. Тем не менее, микроволновая печь с помощью не-aqueous сол-гель маршрут имеет верхний предел размера полученных наночастиц около 12 нм. Эта процедура не будет адаптирована для применения с использованием ферромагнитных частиц при комнатной температуре. В дополнение к синтезу ядра, еще одной главной особенностью, которая будет рассмотрена является покрытие. Лежа на поверхности наночастицы, покрытие выступает в качестве якорной молекулы, помогая целенаправленной интернализации наночастиц, или он может защитить наночастицы от деградации. Так как бензиловый спирт действует как источник кислорода и лиганд в то же время, голые наночастицы производятся без необходимости дополнительных сурфактантов или лигандов. Затем наночастицы легко всплываются после синтеза без процесса обмена сурфактантами.
При этом оцениваются два типа наночастиц, которые обладают одним и тем же ядром и отличаются по покрытию. Ядро синтезируется с использованием быстрой и высокоэффективной микроволновой техники. Два покрытия по сравнению состоят из лимонной кислоты, один из наиболее часто используемых в качестве покрытияагента в биомедицинских приложений 29,30, и полиакрилиновой кислоты (PAA), полимерное покрытие с большим количеством хелатирующих функций. Измерения магнитометрии VSM затем используются сначала для количественной оценки поглощения наночастиц клетками, а затем в качестве прямой оценки структурной целостности наночастиц при интернализации стволовых клеток. Результаты показывают, что концентрация инкубации влияет на поглощение наночастиц и что покрытие влияет на их деградацию, при этом большое количество якорных молекул ПАА защищает ядро от деградации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Используя быстрый и эффективный синтез на основе микроволновой печи, магнитные наночастицы могут быть легко синтезированы, с контролируемым размером, и далее покрыты данной молекулы. Важным шагом является запас железной соли и бензилового спирта в вакууме, чтобы сохранить небольшой д…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Европейским союзом (проект ERC-2014-CoG MaTissE #648779). Авторы хотели бы отметить платформу физико-химических характеристик CNanoMat Парижского университета 13.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
References
- Azevedo-Pereira, R. L., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo. Molecular Biology Reports. 46 (1), 191-198 (2019).
- Fayol, D., Frasca, G., Le Visage, C., Gazeau, F., Luciani, N., Wilhelm, C. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Advanced Materials. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Yamamoto, Y., et al. Preparation of artificial skeletal muscle tissues by a magnetic force-based tissue engineering technique. Journal of Bioscience and Bioengineering. 108 (6), 538-543 (2009).
- Gonçalves, A. I., Rodrigues, M. T., Gomes, M. E. Tissue-engineered magnetic cell sheet patches for advanced strategies in tendon regeneration. Acta Biomaterialia. 63, 110-122 (2017).
- Du, V., et al. A 3D magnetic tissue stretcher for remote mechanical control of embryonic stem cell differentiation. Nature Communications. 8 (1), 400 (2017).
- Amiri, M., Salavati-Niasari, M., Pardakhty, A., Ahmadi, M., Akbari, A. Caffeine: A novel green precursor for synthesis of magnetic CoFe2O4 nanoparticles and pH-sensitive magnetic alginate beads for drug delivery. Materials Science and Engineering: C. 76, 1085-1093 (2017).
- Vangijzegem, T., Stanicki, D., Laurent, S. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics. Expert Opinion on Drug Delivery. 16 (1), 69-78 (2019).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the “hot-spot” effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. Magnetic (Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and in vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Plan Sangnier, A., et al. Targeted thermal therapy with genetically engineered magnetite magnetosomes@RGD: Photothermia is far more efficient than magnetic hyperthermia. Journal of Controlled Release. 279, 271-281 (2018).
- Pham, B. T. T., et al. Biodistribution and Clearance of Stable Superparamagnetic Maghemite Iron Oxide Nanoparticles in Mice Following Intraperitoneal Administration. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Kolosnjaj-Tabi, J., et al. Biotransformations of magnetic nanoparticles in the body. Nano Today. 11 (3), 280-284 (2016).
- Bargheer, D., et al. The distribution and degradation of radiolabeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles and quantum dots in mice. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 111-123 (2015).
- Freund, B., et al. A simple and widely applicable method to 59Fe-radiolabel monodisperse superparamagnetic iron oxide nanoparticles for in vivo quantification studies. ACS Nano. 6 (8), 7318-7325 (2012).
- Singh, S. P., Rahman, M. F., Murty, U. S. N., Mahboob, M., Grover, P. Comparative study of genotoxicity and tissue distribution of nano and micron sized iron oxide in rats after acute oral treatment. Toxicology and Applied Pharmacology. 266 (1), 56-66 (2013).
- Levy, M., et al. Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).
- Briley-Saebo, K., et al. Hepatic cellular distribution and degradation of iron oxide nanoparticles following single intravenous injection in rats: implications for magnetic resonance imaging. Cell and Tissue Research. 316 (3), 315-323 (2004).
- Gu, L., Fang, R. H., Sailor, M. J., Park, J. H. In vivo Clearance and Toxicity of Monodisperse Iron Oxide Nanocrystals. ACS Nano. 6 (6), 4947-4954 (2012).
- Sangnier, A. P., et al. Impact of magnetic nanoparticle surface coating on their long-term intracellular biodegradation in stem cells. Nanoscale. , (2019).
- Mazuel, F., et al. Magneto-Thermal Metrics Can Mirror the Long-Term Intracellular Fate of Magneto-Plasmonic Nanohybrids and Reveal the Remarkable Shielding Effect of Gold. Advanced Functional Materials. 27 (9), 1605997 (2017).
- Van de Walle, A., et al. Biosynthesis of magnetic nanoparticles from nano-degradation products revealed in human stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4044-4053 (2019).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Bee, A., Massart, R., Neveu, S. Synthesis of very fine maghemite particles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 149 (1), 6-9 (1995).
- Feldmann, C., Jungk, H. O. Polyol-Mediated Preparation of Nanoscale Oxide Particles. Angewandte Chemie International Edition. 40 (2), 359-362 (2001).
- Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. Synthesis of Highly Crystalline and Monodisperse Maghemite Nanocrystallites without a Size-Selection Process. Journal of the American Chemical Society. 123 (51), 12798-12801 (2001).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals: Nonaqueous Synthesis, Characterization, and Solubility. Chemistry of Materials. 17 (11), 3044-3049 (2005).
- Richard, S., et al. USPIO size control through microwave nonaqueous sol-gel method for neoangiogenesis T2 MRI contrast agent. Nanomedicine. 11 (21), 2769-2797 (2016).
- Ngo, A. T., Pileni, M. P. Assemblies of Ferrite Nanocrystals: Partial Orientation of the Easy Magnetic Axes. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (1), 53-58 (2001).
- Li, L., et al. Effect of synthesis conditions on the properties of citric-acid coated iron oxide nanoparticles. Microelectronic Engineering. 110, 329-334 (2013).
- Sun, X., et al. Tracking stem cells and macrophages with gold and iron oxide nanoparticles – The choice of the best suited particles. Applied Materials Today. 15, 267-279 (2019).
- Buchner, M., Höfler, K., Henne, B., Ney, V., Ney, A. Tutorial: Basic principles, limits of detection, and pitfalls of highly sensitive SQUID magnetometry for nanomagnetism and spintronics. Journal of Applied Physics. 124 (16), 161101 (2018).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. European Biophysics Journal. 31 (2), 118-125 (2002).
- Jing, Y., et al. Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis. The FASEB Journal. 22 (12), 4239-4247 (2008).
- Van de Walle, A., et al. Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model. Nano Research. , (2020).
