De huidige methoden om de alcoholgevoeligheid in Drosophila te meten zijn ontworpen om groepen vliegen te testen. We presenteren een eenvoudige, goedkope, hoge doorvoer test voor de beoordeling van alcohol sedatie gevoeligheid in grote aantallen enkele vliegen. De methode vereist geen gespecialiseerde gereedschappen en kan worden uitgevoerd in elk laboratorium met behulp van gemeenschappelijke materialen.
Drosophila melanogaster biedt een uitstekend model om de genetische onderbouwing van alcoholgevoeligheid te bestuderen. In tegenstelling tot studies bij menselijke populaties, het Drosophila model maakt strikte controle over de genetische achtergrond, en vrijwel onbeperkt aantal individuen van hetzelfde genotype kan snel worden opgevoed onder goed gecontroleerde omgevingsomstandigheden zonder wettelijke beperkingen en tegen relatief lage kosten. Vliegen blootgesteld aan ethanol ondergaan fysiologische en gedragsveranderingen die lijken op menselijke alcohol intoxicatie, met inbegrip van verlies van posturale controle, sedatie, en de ontwikkeling van tolerantie. Hier beschrijven we een eenvoudige, goedkope, hoge doorvoer test voor het beoordelen van alcohol sedatie gevoeligheid in grote aantallen enkele vliegen. De test is gebaseerd op video-opname van enkele vliegen geïntroduceerd zonder verdoving in 24-well cel cultuur platen in een set-up die synchrone initiatie van blootstelling aan alcohol mogelijk maakt. Het systeem stelt een enkele persoon in staat om individuele ethanol sedatiegegevens te verzamelen over maar liefst 2.000 vliegen binnen een werkperiode van 8 uur. De test kan in principe worden uitgebreid om de effecten van blootstelling aan vluchtige stoffen te beoordelen en toegepast worden op het meten van effecten van acute toxiciteit van vluchtige stoffen op andere insecten, waaronder andere vliegsoorten.
Het National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism meldt dat in 2015 overmatig alcoholgebruik, aangeduid als “alcoholgebruik stoornis”, getroffen naar schatting 16 miljoen mensen in de Verenigde Staten. Alcoholmisbruik veroorzaakt een breed scala van nadelige fysiologische effecten en is een belangrijke doodsoorzaak in de VS. Bij de mens heeft een verminderde gevoeligheid, of een lage respons op alcohol, een sterke genetische component en wordt geassocieerd met een hoger risico op het ontwikkelen van alcoholgebruiksstoornissen1,2,3,4. Genetische risicostudies op menselijke populaties zijn uitdagend vanwege populatievermenging, diverse ontwikkelingsgeschiedenissen en blootstelling aan het milieu, en afhankelijkheid van zelfgerapporteerde vragenlijsten om alcoholgerelateerde fenotypen te kwantificeren, die vaak verward zijn met andere neuropsychiatrische aandoeningen.
Drosophila melanogaster biedt een uitstekend model om de genetische onderbouwing van alcoholgevoeligheid5,6,7,8te bestuderen. Het Drosophila-model maakt strikte controle over de genetische achtergrond mogelijk, en vrijwel onbeperkte aantallen individuen van hetzelfde genotype kunnen snel worden gefokt onder goed gecontroleerde omgevingsomstandigheden zonder wettelijke beperkingen en tegen relatief lage kosten. Naast openbaar beschikbare mutaties en RNAi-lijnen die gericht zijn op een meerderheid van de genen in het genoom, heeft de beschikbaarheid van het Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP), een populatie van 205 ingeteelde wild afgeleide lijnen met volledige genoomsequenties, genoombrede associatiestudies9,10mogelijk gemaakt. Dergelijke studies hebben genetische netwerken geïdentificeerd die verband houden met effecten op de ontwikkelingstijd en levensvatbaarheid bij blootstelling aan ethanol11,12. Evolutionaire conservering van fundamentele biologische processen maakt het mogelijk translationele conclusies te trekken door het overplaatsen van menselijke orthologs op hun vlieg tegenhangers.
Vliegen blootgesteld aan ethanol ondergaan fysiologische en gedragsveranderingen die lijken op menselijke alcoholintoxicatie, met inbegrip van verlies van posturale controle8, sedatie, en ontwikkeling van tolerantie13,14,15. Alcohol geïnduceerde sedatie in Drosophila kan worden gekwantificeerd met behulp van inebriometers. Dit zijn 122 cm lange verticale glazen kolommen met schuine mazen waar vliegen16,17,18aan kunnen bevestigen . Een groep van ten minste 50 vliegen (geslachten kunnen afzonderlijk worden geanalyseerd) worden geïntroduceerd in de bovenkant van de kolom en blootgesteld aan ethanol dampen. Vliegen die posturale controle verliezen vallen door de kolom en worden verzameld met intervallen van 1 minuten. De gemiddelde elutietijd dient als een maat voor de gevoeligheid voor alcoholintoxicatie. Wanneer vliegen een tweede keer na herstel van de eerste blootstelling aan alcohol worden blootgesteld, kunnen ze tolerantie ontwikkelen, zoals blijkt uit een verschuiving in gemiddelde elutietijd13,15,19,20. Overwegende dat inebriometer testen hebben geleid tot de identificatie van genen, genetische netwerken, en cellulaire trajecten in verband met alcohol sedatie gevoeligheid en de ontwikkeling van tolerantie12,13,14,21, de test is tijdrovend, lage doorvoer, en ineffectief voor het meten van alcohol gevoeligheid in enkele vliegen.
Alternatieve ethanol sedatie tests die niet nodig de uitgebreide inebriometer set-up zorgen voor meer handige metingen, maar zijn nog steeds beperkt in doorvoer en in het algemeen vereisen analyses van groepen vliegen in plaats van individuen21,22,23,24,25. Het beoordelen van enkele vliegen minimaliseert de kans op verstorende effecten als gevolg van groepsinteracties, zoals die welke voortvloeien uit sociaal gedrag. Hier presenteren we een eenvoudige, goedkope, hoge doorvoer test voor de beoordeling van alcohol sedatie gevoeligheid in grote aantallen enkele vliegen.
Hier presenteren we een eenvoudige, goedkope en hoge doorvoer methode voor het beoordelen van sedatie tijd als gevolg van blootstelling aan ethanol in Drosophila melanogaster. In tegenstelling tot veel huidige methoden, waarvoor groepsanalyses nodig zijn, stelt deze test een enkele persoon in staat om individuele sedatietijdgegevens te verzamelen voor ~ 2.000 vliegen binnen een werkperiode van 8 uur. We vonden dat een enkele persoon kan scoren 48 vliegen voor sedatie tijd in ongeveer 5 min. In dit tempo kunnen 2.000 vliegen worden gescoord in ongeveer 4 uur, hoewel scoren later kan worden uitgevoerd. Met onze test varieert de geregistreerde sedatietijd voor de meeste vliegen van 5-15 min bij blootstelling aan 1 mL van 100% ethanol. Lagere concentraties ethanol of kleinere leveringsvolumes zullen resulteren in langere sedatietijden.
De huidige methoden voor de beoordeling van de sedatietijd vereisen het testen van grote aantallen vliegen zonder metingen op alleenstaanden15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Veel huidige sedatie en gevoeligheidstesten zijn afhankelijk van ST5022,23,24, het tijdstip waarop 50% van de vliegen wordt verdoofd als gevolg van blootstelling aan ethanol. Hoewel het verkrijgen van de ST50 voor groepen vliegen niet de primaire motivatie was om deze test te ontwikkelen, tonen de video-opnamen een hoger nut aan in vergelijking met de huidige methoden, omdat de opnames kunnen worden gebruikt om de ST50 vast te stellen voor groepen individueel geteste vliegen en om het percentage vliegen te meten dat aan een bepaald criterium voldoet (bijvoorbeeld verlies van posturale controle) op elk moment. Opgemerkt moet worden dat dergelijke video-analyses extra tijd zouden vergen.
In tegenstelling tot de huidige inebriometer testen, de methode die we beschrijven vereist geen gespecialiseerde tools op te zetten en kan worden uitgevoerd in elk laboratorium met behulp van gemeenschappelijke materialen. Met behulp van deze methode hebben we betrouwbare en consistente sedatietijden voor individuele vliegen verkregen. De test kan in beginsel worden uitgebreid om de effecten van blootstelling aan vluchtige stoffen te beoordelen. De test kan ook worden toegepast om effecten van acute toxiciteit van vluchtige stoffen op andere insecten, waaronder andere vliegsoorten, te meten. Individuele sedatietijdgegevens kunnen worden gebruikt om de mate van fenotypische variatie binnen een populatie, zoals de DGRP, te beoordelen.
We gebruikten kleine insectenzeefnetjes om direct contact met de ethanoloplossing te voorkomen, terwijl we voldoende hoeveelheden ethanoldampen de vlieg konden bereiken. De laag witte kaasdoek op de top van het scherm mesh biedt visueel contrast tussen de vlieg en het oppervlak hieronder en zorgt ervoor dat vliegen niet verstrikt raken in het scherm mesh, wat kan leiden tot dubbelzinnige bepaling van het verlies van posturale controle. Commercieel verkrijgbare membranen die poreus zijn voor water en lucht gaven inconsistente resultaten en waren onvoldoende doordringbaar voor ethanoldampen. We hebben bewust gebruik gemaakt van kleine insect scherm gaas, omdat het een uniform poreus materiaal dat variatie in ethanol blootstelling minimaliseert als gevolg van vlieg positie binnen een put. Wijzigingen kunnen worden aangebracht in dit protocol op basis van beschikbare materialen, hoewel we raden een gecontroleerde gedragskamer, toegang tot 90%-100% ethanol dicht bij de vlieg, en uniforme ethanol blootstelling.
Vlieg positie binnen de cel cultuur platen moeten worden gerandomiseerd tussen repliceert om positionele bias te voorkomen. Voor grotere experimenten die gebruik van deze test over meerdere dagen vereisen en daarom onderhevig zijn aan omgevingsvariatie die de resultaten van de test kan beïnvloeden (bijvoorbeeld veranderingen in de barometerdruk)27,raden we ten zeerste aan dat vliegen elke dag op hetzelfde tijdstip worden getest en gerandomiseerd, zowel binnen als over dagen, vooral als verschillende lijnen en/of geslachten met elkaar moeten worden vergeleken.
De methode die we hebben ontwikkeld is het meest geschikt voor het meten van het effect van acute blootstelling aan alcohol, maar is niet geschikt voor het verkrijgen van consumptiegegevens of modelleringsverslaving. Gegevens over de gevoeligheid van alcoholsedatie die uit deze test zijn verkregen, kunnen echter worden geïntegreerd met andere maatregelen van alcoholgerelateerde fenotypen. Een beperking van het systeem is dat de verticale hoogte van standaard celcultuurplaten verticale vliegbewegingen mogelijk maakt die niet gemakkelijk door video kunnen worden gevolgd voor een gedetailleerde beoordeling van de algehele activiteit of bewegingsvrijheid. Deze beperking heeft echter geen invloed op een nauwkeurige beoordeling van de sedatietijd. Bij het gebruik van vliegen van verschillende genotypen (bijvoorbeeld in DGRP-afgeleide uitgefokte populaties28), maakt deze test het ook mogelijk om individuele vliegen op te halen om zwembaden van vliegen te verzamelen met contrasterende fenotypes voor bulk DNA-sequencing en extreme QTL mapping29,30. Globaal, staat deze test snelle, goedkope inzameling van de gegevens van de alcoholsedatie op grote aantallen enige vliegen toe.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies DA041613 en GM128974 van de National Institutes of Health aan TFCM en RRHA.
24-well Cell Culture Plates | Corning | 3526 | Flat-bottomed; will house flies throughout assay |
Aspirator | |||
Cheesecloth | Genesee Scientific | 53-100 | Widely available. |
Ethanol | Decon Labs | V1001 | Widely available. |
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) | Walmart | 550098612 | Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well. |
Gauze (for aspirator) | Honeywell North | 67622 | Widely available. |
Illumination Pad | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Any light pad to provide contrast is suitable. |
Jumbo Craft Sticks | Michaels | 10334892 | Any craft stick at least 7 cm long is suitable. |
P1000 Pipette Tip (for aspirator) | Genesee Scientific | 24-165RL | Any P1000 pipette tip is suitable. |
Serological Pipette (for aspirator) | Genesee Scientific | 12-104 | |
Small Insect Screen Mesh | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Any small insect screen mesh is suitable. |
Testing Chamber | Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box. | ||
Tygon Tubing (for aspirator) | Grainger | 9CUG7 | Widely available. |
Video Camera | Canon | 1959C001AA | Any video camera is suitable. |