공초점 현미경 검사법에 의한 단세포 인천성형광서명의 재구성
Summary
여기서, 3차원 공간에 분포된 모든 개별 라이브 셀로부터 광적으로 추출 및 분류하는 프로토콜(즉, 세포 자동 형광)을 제시한다. 이 방법은 박테리아, 곰팡이, 효모, 식물 및 동물의 세포를 포함하여 단일 세포 해상도에서 다양한 생물학적 시스템의 타고난 형광 서명을 연구하는 데 적합합니다.
Abstract
여기서 설명된 공초점 반사 현미경 보조 단세포 인천성광 분석(CRIF),3차원(3D) 공간에 분포된 인구에서 각 개별 라이브 셀로부터 선천적인 세포 형광 시그니처를 재구성하는 최소 침습적 방법이다. 세포의 타고난 형광 시그니처는 세포 내의 다양한 생체 분자에 의해 방출되는 형광 신호의 모음입니다. 이전 연구는 타고난 형광 서명이 다양한 세포 특성과 생리적 상태의 차이를 반영하고 세포 특성화 및 식별을위한 풍부한 정보 소스임을 확립했습니다. 선천적 형광 서명은 전통적으로 인구 수준에서 분석되어 복제 배양을 필요로하지만 단일 세포 수준에서는 그렇지 않습니다. CRIF는 개별 세포에서 형광 신호의 3D 해상도 및/또는 선택적 추출을 요구하는 연구 결과에 특히 적합합니다. 형광 서명은 세포의 타고난 특성이기 때문에 CRIF는 그대로 및 단일 세포의 유형 및 / 또는 생리 적 상태의 태그없는 예측에도 적합합니다. 이 방법은 이종 집단에서 각 단일 세포의 표현형이 세포 태그없이 현미경의 밑에 그것의 자동 형광 서명에 의해 직접 평가될 수 있는 능률적인 세포 분석을 위한 강력한 공구일 지도 모릅니다.
Introduction
셀1 내의 다양한 생체 분자는 자가 형광 신호를 방출하고, 세포의 타고난 형광 서명은 이러한 신호의 조립으로 구성된다. 이 시그니처 형광은 다양한 세포 특성과 생리적 상태의 차이를 반영합니다. 선천적 형광의 분석은 최소 침습적이며 온화한 신진 대사 수정에서 완전한 세포 파괴에 이르기까지 다양한 흔적을 남기는 전통적인 침습적 미생물 프로브를 보완 할 수 있습니다. DNA 또는 세포 함량 추출2,3, 시투 혼성화4의 형광등, 그리고 게놈에 형광 기자 유전자의 도입과 같은 전통적인 기술은 세포 유형 또는 생리적 상태를 결정하는 데 효과적이지만, 일반적으로 세포의 조작또는 침습적 태깅이 필요합니다.
벌크 미생물 배양 현탁액5,6, 활성 슬러지7, 포유류 조직8,9 및 포유류 세포를 포함한 다양한 살아있는 및 그대로 미생물 식민지의 타고난 형광에 대한 연구는 선천성 형광 분석이 세포 유형 및 생리 상태의 태그 없는 분석을 용이하게 하는 것으로 나타났습니다. 선천적 형광 서명은 전통적으로 단일 세포 수준이 아닌 인구 수준에서 분석되어 클론 배양을 필요로합니다. 대조적으로, confocal refction microscopy-보조 단세포 innate fluorescence 분석 (CRIF) 기술11 여기에 설명된 각 개별 살아있는 미생물 세포의 타고난 세포 형광 서명을 재구성하고 카탈로그합니다. 더욱이, CRIF는 3차원(3D) 공간에 분포되는 집단 내에서 단일 미생물 세포의 선천적 형광 서명을 체계적으로 대조할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
재현 가능한 결과를 얻기 위해 밀접하게 따라야 하는 두 가지 중요한 점이 있습니다: 1) 심내 목표하에서 레이저 전력 출력을 관찰하고, 2) 정확한 세포 세분화를 수행한다.
첫 번째 점은 다른 실험 중 타고난 형광 서명을 비교할 때 특히 중요합니다. 최대 전력 출력이 레이저 라인 간의 크기 순서까지 다를 수 있기 때문에 단순히 동일한 “백분율 출력” 설정을 여기 파장(예: 405, 4…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 일본 교육문화체육관광부(18K04843)에서 YST ERATO(JPMJER1502)에서 N. 노무라까지 과학연구보조금으로 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
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