Reconstrução de assinaturas de fluorescência inata de células únicas por microscopia confocal
Summary
Aqui, é apresentado um protocolo para extração óptica e catalogação de assinaturas de fluorescência celular inata (ou seja, autofluorescência celular) de cada célula viva individual distribuída em um espaço tridimensional. Este método é adequado para estudar a assinatura de fluorescência inata de diversos sistemas biológicos em uma resolução unicelular, incluindo células de bactérias, fungos, leveduras, plantas e animais.
Abstract
Descrito aqui é a análise de fluorescência unicelular assistida por microscopia de reflexão confocal (CRIF), um método minimamente invasivo para reconstruir a assinatura de fluorescência celular inata de cada célula viva individual em uma população distribuída em um espaço tridimensional (3D). A assinatura de fluorescência inata de uma célula é uma coleção de sinais de fluorescência emitidos por várias biomoléculas dentro da célula. Estudos anteriores estabeleceram que as assinaturas de fluorescência inata refletem várias propriedades celulares e diferenças no estado fisiológico e são uma rica fonte de informação para caracterização e identificação celular. As assinaturas de fluorescência inata têm sido tradicionalmente analisadas no nível populacional, necessitando de uma cultura clonal, mas não no nível de célula única. O CRIF é particularmente adequado para estudos que requerem resolução 3D e/ou extração seletiva de sinais de fluorescência de células individuais. Como a assinatura de fluorescência é uma propriedade inata de uma célula, o CRIF também é adequado para a previsão livre de tags do tipo e/ou status fisiológico de células intactas e únicas. Este método pode ser uma ferramenta poderosa para análise celular simplificada, onde o fenótipo de cada célula em uma população heterogênea pode ser diretamente avaliado por sua assinatura de autofluorescência sob um microscópio sem marcação celular.
Introduction
Diversas biomoléculas dentro de uma célula1 emitem sinais de autofluorescência, e a assinatura de fluorescência inata de uma célula consiste na montagem desses sinais. Essa fluorescência de assinatura reflete várias propriedades celulares e também diferenças no estado fisiológico. A análise da fluorescência inata é minimamente invasiva e pode complementar sondas microbiológicas tradicionais e mais invasivas que deixam uma gama de vestígios desde modificações metabólicas leves até destruição celular completa. Enquanto técnicas tradicionais como extração de DNA ou conteúdo celular2,3, hibridização fluorescente in situ4, e a introdução de genes repórteres fluorescentes ao genoma são eficazes na determinação do tipo celular ou status fisiológico, eles geralmente requerem manipulação das células ou marcação invasiva.
Estudos da fluorescência inata de várias colônias microbianas vivas e intactas, incluindo suspensões de cultura microbiana a granel5,6, lodo ativo7, tecidos mamíferos8,9 e células mamíferas1,10, mostraram que a análise de fluorescência inata facilita a análise livre de etiquetas de tipos celulares e status fisiológico. As assinaturas de fluorescência inata têm sido tradicionalmente analisadas no nível populacional e não no nível de célula única, e, portanto, necessitam de uma cultura clonal. Em contraste, a técnica de análise de fluorescência unicelular assistida por microscopia confocal (CRIF) descrita aqui reconstrói e cataloga a assinatura de fluorescência celular inata de cada célula microbiana viva individual. Além disso, o CRIF pode sistematicamente reunir a assinatura de fluorescência inata de uma única célula microbiana dentro de uma população que é distribuída em um espaço tridimensional (3D).
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem dois pontos críticos neste método que precisam ser acompanhados de perto para obter resultados reprodutíveis: 1) manter a saída de energia laser sob o objetivo do microscópio consistente através de comprimentos de onda e experimentos de excitação, e 2) realizar segmentação celular precisa.
O primeiro ponto é particularmente importante quando se compara a assinatura de fluorescência inata entre diferentes experimentos. Evite simplesmente aplicar as mesmas configurações de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado em parte por uma subvenção em auxílio para pesquisas científicas do Ministério da Educação, Cultura, Esportes e Tecnologia do Japão (18K04843) para Y. Yawata, o JST ERATO (JPMJER1502) para N. Nomura.
Materials
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
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