Reconstructie van eencellige aangeboren fluorescentiehandtekeningen door confocale microscopie
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het optisch extraheren en catalogiseren van aangeboren cellulaire fluorescentiehandtekeningen (d.w.z. cellulaire autofluorescentie) van elke individuele levende cel verdeeld in een driedimensionale ruimte. Deze methode is geschikt voor het bestuderen van de aangeboren fluorescentiesignatuur van diverse biologische systemen met een eencellige resolutie, waaronder cellen van bacteriën, schimmels, gisten, planten en dieren.
Abstract
Hier beschreven is confocale reflectie microscopie-geassisteerde eencellige aangeboren fluorescentie analyse (CRIF), een minimaal invasieve methode voor het reconstrueren van de aangeboren cellulaire fluorescentiesignatuur van elke individuele levende cel in een populatie verdeeld in een driedimensionale (3D) ruimte. De aangeboren fluorescentiesignatuur van een cel is een verzameling fluorescentiesignalen die worden uitgezonden door verschillende biomoleculen in de cel. Eerdere studies hebben vastgesteld dat aangeboren fluorescentiehandtekeningen verschillende cellulaire eigenschappen en verschillen in fysiologische status weerspiegelen en een rijke bron van informatie zijn voor celkarakterisering en identificatie. Aangeboren fluorescentiehandtekeningen zijn traditioneel geanalyseerd op populatieniveau, waardoor een klonale cultuur nodig is, maar niet op het niveau van één cel. CRIF is met name geschikt voor studies die 3D-resolutie en/of selectieve extractie van fluorescentiesignalen uit individuele cellen vereisen. Omdat de fluorescentiesignatuur een aangeboren eigenschap van een cel is, is CRIF ook geschikt voor tag-vrije voorspelling van het type en/of fysiologische status van intacte en enkele cellen. Deze methode kan een krachtig hulpmiddel zijn voor gestroomlijnde celanalyse, waarbij het fenotype van elke afzonderlijke cel in een heterogene populatie direct kan worden beoordeeld aan de hand van zijn autofluorescentiesignatuur onder een microscoop zonder cellabels.
Introduction
Diverse biomoleculen in een cel1 zenden autofluorescentiesignalen uit en de aangeboren fluorescentiesignatuur van een cel bestaat uit de assemblage van deze signalen. Deze kenmerkende fluorescentie weerspiegelt verschillende cellulaire eigenschappen en ook verschillen in fysiologische status. Analyse van aangeboren fluorescentie is minimaal invasief en kan een aanvulling vormen op traditionele, meer invasieve microbiologische sondes die een reeks sporen achterlaten van milde metabole modificatie tot volledige celvernietiging. Hoewel traditionele technieken zoals DNA- of celinhoudextractie2,3, fluorescerende in situ hybridisatie4 en de introductie van fluorescerende reportergenen in het genoom effectief zijn bij het bepalen van het celtype of de fysiologische status, vereisen ze vaak manipulatie van de cellen of invasieve tagging.
Studies naar de aangeboren fluorescentie van verschillende levende en intacte microbiële kolonies, waaronder bulk microbiële cultuursuspensies5,6, actief slib7, zoogdierweefsels8,9 en zoogdiercellen1,10, hebben aangetoond dat aangeboren fluorescentieanalyse tagvrije analyse van celtypen en fysiologische status vergemakkelijkt. Aangeboren fluorescentiehandtekeningen zijn traditioneel geanalyseerd op populatieniveau en niet op het niveau van één cel, en vereisen dus een klonale cultuur. Daarentegen reconstrueert en catalogiseert de confocale reflectionmicroscopie-geassisteerde eencellige innate fluorescence analysis (CRIF) –techniek11 de aangeboren cellulaire fluorescentiesignatuur van elke individuele levende microbiële cel. Bovendien kan CRIF systematisch de aangeboren fluorescentiesignatuur van een enkele microbiële cel verzamelen binnen een populatie die is verdeeld in een driedimensionale (3D) ruimte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn twee kritieke punten in deze methode die nauwlettend moeten worden gevolgd om reproduceerbare resultaten te verkrijgen: 1) houd het laservermogen onder het microscoopobject objectief consistent door excitatiegolflengten en experimenten, en 2) voer nauwkeurige celsegmentatie uit.
Het eerste punt is vooral belangrijk bij het vergelijken van de aangeboren fluorescentiesignatuur tussen verschillende experimenten. Vermijd eenvoudigweg het toepassen van dezelfde “procent output” -instellinge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door een subsidie-in-steun voor wetenschappelijk onderzoek van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport en Technologie van Japan (18K04843) aan Y. Yawata, de JST ERATO (JPMJER1502) aan N. Nomura.
Materials
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
References
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
- Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
- Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
- Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
- Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289 (2017).
- Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
- Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453 (2016).
- Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
- Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
- Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , (2006).
- Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461 (2014).
